一，引物设计:1,选择合适的载体。酶切位点及其顺序（酶切位点的顺序一定不能颠倒）。2，在NCBI上再次确认目的片段的碱基序列。1，使用word排除目的片段里含有的酶切位点，最后确定所使用的酶。2，设计引物：primer-up：---------Primer-down：-----------3，核对----送公司合成。4，对公司合成的引物离心，10000rpm、5-10分钟、at4℃，在超净台按照管子上标注的体积加入高压水（2dH2O），再把上游引物和下游引物混在一起，at4℃保存。二，PCR（P出目的片段）：（一）、从韩家淮实验室赠送的菌液里P出目的片段：1，揺菌过夜：2ul韩家淮实验室的菌液，Xul相应的抗生素3mlLB94℃5min2,pcr:菌液1ul94℃30sec2xPFUmix25ul58℃30secPrimer1ul72℃Xmin2dH2O23ul72℃5min（X是根据片段的长度设定，500-1000bp/min，退火温度根据Tm值来计算，一般低于Tm值2℃）3，跑胶、回收:（1），配胶：称0.6g的琼脂糖加入60ml的1XTAE加入0.6ul的EB(待温度降到50-60℃左右时)25分钟后，即可点样跑胶。（2），跑胶：130-150V、25-30分钟左右。（3），紫外灯下观察，切胶（要带防护手套和口罩）4，做胶回收（天根{TIANGEN}公司的DNA纯化回收试剂盒）:按照试剂盒的protocol来做，在胶回收的最后一步，ElutionBuffer预先在55-65℃温箱中水浴，并且在加过EB后，放在37℃温箱中2min。对胶回收的产物跑胶验证。可建立10ul的体系：回收产物2ul、10xloadingbuffer2ul、2dH2O6ul。三，酶切、链接：1，目的片段酶切：（37℃酶切过夜或者4小时）insert：上述胶回收产物35ul10xHbuffer（1.5x）7ul50ul的体系ddH2O6ul保护碱基4个上游酶切位点首位20个碱基保护碱基4个下游酶切位点末尾20个碱基的反向互补碱基15ml离心管Pcr(50ul)反应体系Pcr温度体系33cycles1%的琼脂糖胶：大块煮沸3次酶11ul酶21ul2，载体酶切：（37℃酶切过夜或者4小时）Vector（1ug/ul）：2ul10xbuffer（1.5x）3ul20ul的体系ddH2O13ul酶11ul酶21ul为方便以后使用，载体可以一次性多切点。3，酶切时，首先要核对一下酶的buffer，有时双酶切时两个酶不能共用一种buffer，那么就要先切一端，酶切回收后再用另一酶切另一端，然后再酶切产物回收。4，连接：2xRapidLigation6ulVector0.8ul12ul的体系insert4.5ul（目的是为了多加点insert）T4DNALignase1ul四，转化：{⑴、冰上20分钟-→热激：42℃、90秒-→冰上2分钟⑵、加1mlSOC（或者1mlLB），37℃、180rpm、45分钟。⑶、将上述转化后的菌液加入到100ml的LB中。再按抗生素：...
