——Epi_Lab董世华2014.08.23染色质免疫共沉淀高通量测序文库的构建（ChIP-Seq）目录•高通量测序简介；•IlluminaSolexa原理简介；•ChIP–Seq文库构建；ChIP回顾文库扩增低通量Sanger测序并行测序高通量两端加测序接头PCR扩增高通量测序1高通量测序简介•高通量测序:一次性对几百万到几十亿条DNA分子进行并行测序，其使得可对一个物种的转录组、基因组以及表观基因组进行深入、细致、全貌的分析，所以又被称为深度测序。•High-throughputSequencing•NextGenerationSequencing•DeepSequencing1高通量测序简介测序仪品牌技术原理开发商Roche454焦磷酸测序RocheIlluminaSolexa边合成边测序IlluminaABISOLiD基于磁珠的大规模并行连接测序ABIHelicos单分子荧光测序HelicosIonTorrent半导体测序ABISMRT单分子实时测序PacificBio1现有主要高通量测序仪开发商•桥式PCR•边合成边测序•可逆终止物2IlluminaSolexa简介2.1第一步文库构建①④③②⑤2.2第二步生成簇-桥式PCR⑥⑾⑩⑨⑦⑧2.2第二步生成簇-桥式PCR2.3第三步测序2.3.1测序-Read1测序2.3.1测序-Read1测序2.3.2测序-Index测序①④③②⑤2.3.3测序-Read2测序•DNA测序全基因组denovo测序基因组重测序人类外显子组捕获测序•RNA测序转录组测序小RNA测序•表观基因组研究DNA甲基化测序ChIP-Seq•读长较短，100－150bp；•通量高，200-300G每Run；•低成本，成熟的流程；2.4Solexa的特点与高通量测序应用范围染色质免疫共沉淀产物高通量测序文库的构建ChIP一、末端补平与纯化二、3’加A和纯化三、加接头四、胶回收五、PCR扩增六、胶回收第一天8.24第二天8.253.1.1末端补平•利用T4DNAPolymerase和KlenowDNApolymerase将DNA的末端补平。•补平：•轻轻混匀，瞬离。室温（25℃）30minDNA10ng10XBufffer5ulRepairMix2.5ulddH2OTo50ul•加入5倍体积（250ul）bufferPB，轻弹充分混匀，瞬离；•转至柱子中，13000rpm离心30s，弃下清。•加入750ulbufferPE，13000rpm离心1min,弃下清；•再加入500ulbufferPE，再洗涤一次，弃下清；•盖上盖子，空转2min；•将吸附柱转移到干净的1.5mlEP管中，打开吸附柱盖子，晾干5~10min。•加44ulEB（膜中央，但不能戳破膜），静置1min，13000rpm离心1min，将洗脱下来的液体重新吸到吸附柱中，重复洗脱一次。3.1.2纯化•利用Klenow(3’->5’exo-)的聚合酶活性在磷酸化的平端DNA的3’端加A，得到的DNA可以和3’端带有单个T碱基的接头进行连接。•3’加A：•共50ul体系，3...
