蛋白纯化[公众微信号：bioworlde].pptVIP免费

基因克隆与亚克隆蛋白质表达与纯化基因克隆与亚克隆蛋白质表达与纯化亚克隆技术步骤获取目的片断双酶切载体和目的片断纯化回收载体和目的片断连接载体和目的片断转化E.Coli鉴定获取目的基因•基因组文库•cDNA文库•PCR或酶切原核基因真核基因双酶切载体和目的片断•任何时候2种酶的总量不能超过反应体系的1/10体积。•如果有一种buffer能同时使2种酶的活力都超过70%的话，就可以用这种buffer作为反应buffer。•酶切PCR产物需要保护碱基，在设计引物时需要注意。切胶回收和连接回收•切下的胶要尽可能小•胶的浓度不要太高•切胶后进行定量和纯度分析连接●载体和目的基因的摩尔比为1：3～10转化感受态细胞•感受态的制备最好从-70ºC冰箱里直接取细菌菌种，或者涂板后挑单菌落，摇细菌制备•一步法转化可以大大节省时间•一般转化后需要12～16小时长成单菌落，时间太长容易影响细菌活性克隆的鉴定•PCR或者快速PCR•酶切鉴定•测序鉴定上游引物TCAGGACATATGATGGACCAGAAGCTNdeIGTTAACG下游引物ACTGAGGGATCCTCAGGTGTGTTTAABamHIAGCTGTT分子克隆示例引物设计载体和目的基因双酶切重组质粒pET28a-gadA琼脂糖电泳（左）、双酶切（中）、质粒PCR（右）及测序鉴定测序融合蛋白的表达与纯化重组蛋白可溶性表达原理His纯化系统是利用His融合蛋白的6,8或10连续的组氨酸残基与固定的二价Ni2+通过金属亲和吸附，通过咪唑洗脱的原理来进行纯化。1ml树脂大约可结合5–8mg融合蛋白，并且可以反复使用几次。The6×Histag在C-或N-末端均可pH8.0分子量小，不干扰目的蛋白的结构与功能NTA特点：NTA(Nitrilotriaceticacid)是一种四配位基的金属吸收剂NTA占住Ni2+的四个位点,留下2个与6×His结合.试剂•IPTG:异丙基硫代-β-D-半乳糖苷•8bindingbuffer:•40mMimidazole•4MNaCl•160mMTris-HCl,pH7.9•8washbuffer:•480mMimidazole•4MNaCl•160mMTris-HCl,pH7.9•8elutebuffer:•4Mimidazole•2MNaCl•80mMTris-HCl,pH7.9•Ni2+-NTAHis•BindResin操作步骤•挑一个克隆至2mlLB液中（Amp+）•37℃摇OD600值至0.6左右•加此2ml菌至100mlLB中•37℃摇OD600值至0.6左右•加IPTG至终浓度1mM•继续摇2～3小时•离心（5000rpm,5min,4℃）•悬浮细菌于10×柱体积的bindingbuffer•超声破碎细胞•离心(12,000rpm,15min,4℃),取上清•用滤纸过滤•加0.5mlNi2+-NTAHis•BindResin于层析柱•10×柱体积的bindingbuffer洗层析柱•样品过柱•6×柱...