45整合子介导大肠埃希菌和克雷伯菌多重耐药机制的研究_顾兵.pdf

.基础实验诊断研究整合子介导大肠埃希菌和克雷伯菌多重耐药机制的研究顾兵童明庆刘根焰倪芳赵旺胜梅亚宁文怡魏源华黄佩裙潘世扬【摘要】目的研究整合子参与大肠埃希菌和克雷伯菌多重耐药的分子机制。方法纸片扩散法测定16株临床分离的大肠埃希菌和克雷伯菌的药物敏感性;整合酶基因扩增法检测I类、n类和l类整合子;整合子可变区扩增并测序。结果73.8%(45/)6 l的菌株I类整合子阳性,2株大肠埃希菌n类整合子阳性,未检测到l类整合子;8 8.9%(4 0 4/5)的I类整合子阳性菌株可变区扩增阳性,扩增片段大小从15 0一2 so ob P不等,有l株n类整合子阳性菌株可变区扩增阳性,大小为2 20 0bp;整合子可变区含有编码对氨基糖昔类抗生素耐药的基因(a adA I、a adAZ、a a dA S、a a dB、a a c4 A、皿涌-b I)、编码对磺胺类抗生素耐药的基因(d斤A l、df r Zd、d f rV、d f rx l l、d frl 7)、编码对抓霉素耐药的基因(ca t、ca tB S、c耐l A一vi a ra nt)、编码对 p一内酞胺类抗生素耐药的基因(b ll。)和编码对链丝菌素耐药的基因(a s tl)。结论整合子在大肠埃希菌和克雷伯菌中广泛存在,参与了这两种菌多重耐药的形成。【关扭词】整合子类;大肠杆菌;克雷伯菌属;抗药性,多药So tdyo nh tem eeha r山mo finteg ro nm日肚ate dm u lti.r留is切口c ei nE.叨U助dlKeb sl e ua UiBg n,r 口 刀召i Mg n一i qg n,uU晓n一a yn,N la Fn g,z 月 摊口Wag n一h s eg n,材曰 a Y一成g n,W百脚 i Y,w E了h姐n一ha u,HU A刀Ge Pi和n,P ANh Si一y a.n ge D r时n e In to fi c lin c以肠加a ro ti e s r,h e tFi”t沟 苏l她d e to H胡ia l to fa Ni n jg nM ei d ca ln U俪is ry t,a Ni n jg nZ I佣2夕,h Cia n肠能明。i d ng na以hor:r口Ni Mg n一砰g n,召砌艺l:m qo tg n1.6 3c omAbs ta rc t】ob jic e tv eo Tinv e s“a s tethemo feeu l a rme eha nismo fine t脚nmedia e tdm己it-e rsis ta neeinE.c olia ndl Kebsiel l凡Methd osAntibio tiesus e eptibiliy tO f61si a t rn sofeliniea liso fa tedE.eo liad nl Kebsiel lawa ste sted byK一Bmeh td o.Cla ssl,1 1 a nd1 1 1in teg ro n sw ee rdete ee tdbyinteg a rs eg en eP CR.h Tevi a ra blee ri gonofinte脚nw ee ramPlii fedbyinteg o rnC PR,a ndh tePCRpo rdu etswee rs e甲e n e ed.Re s u ls t73.8%(4 56/l)O fh tesa t rin sw ee rsho w ntoh aea l ss1ine t脚n卯sitiv e,w tost面n sO fEeoliwee rsho w ntobeela s s1 1inte脚npositive,a ndn oela ss1 1 1in te脚na w sdee teted.8 8.9%(4 0/4 5)O fthepo sitiv esia t rn sO fela ss1ine t脚nc o ntain eda罗n eea ss et te,whiehsizedf o rm150 bpto2 80 0bp,a ndoneela ss1 1ine t脚npo sitivesa t rine on面n eda22X()bpsize邵n eea ss et te.D NAs equ eneinga wsu s edtoidentif ythe罗n etiee o nte ntO ftheine t脚nvi a ra blee ri go ns.h Te s e罗n eea ss et te sineld uedgen e se n cd einge rsista ne etoa而n og l邪o sides(a ad AI,a a dA Z,朋山巧,a a dB,a a c从,叨涌一巧),s ula fmeh to xa zole/ti rmeh topi rm(d f rA I,d f rZd,d f rV,d f rX l l,d f rl7),eh la o m rph enie ol(e at,ea tBS,el n lAI一vi a ra nt),p一la ca tms(blao xa,。)a ndste rptothirein(s atl).Conc】u sionIne tg ro n sa e ri wdespe ra dinE.e olia ndl Kebsiellaandmedia e th temu l ti一e rsista ne eO fh tetw osPeeie s.【e Kyw o心】Inte脚n s;Es eheirei haeo li;幻ebsiel la;Du rge roisa t ne e,mu ltiple抗菌药物的大量及不合理使用促进了细菌耐药现象的日趋严峻,耐药基因的水平传播又常常导致耐药菌的暴发流行及细菌对抗生素的多重耐药,细菌耐药已成 为一个全球性的问题。198 9年,t So ke s等首次提 出了一个与耐药基因水平传播有关的新的可移动基因元件整合子(i n teg o rn,玩),整合子是一个新的具有位点特异性重组功能的可移动元件,由两个保守区及其间的基因盒构成,基因盒可含有1个或多个耐药基因。本研究通过基因扩增和测序的方法探讨整合子在大肠埃希菌和克雷伯菌中的分布和整合子携带耐药基因盒的种类。材料和方法作者单位:2 10 029南京医科大学第一附属医院临床检验中心通讯作者:童明庆,电子信箱:mq o tn g1 63.co m一、材料1.菌株:2X()2年6月至20 03年6月本院临床检验中心从血液、尿液和痰等标本 中分离的6 1株不重复菌株:4 7株大肠埃希菌、o r株肺炎克雷伯菌和4株产酸克雷伯菌。所有菌株经AIP板条鉴定。2.仪器与试剂:PC R扩增仪(州公司叮C-10 0);凝胶成像分析系统(K odak公司)。TaqNDA聚合酶和dNTPs等为r oPmega公司产品:pM D18一T载体、I叮G、X一Gla和感受态细 菌DH5a均 为TaKaRa公司产品;质粒小量抽取试剂盒和DNA凝胶回收试剂盒均为Omeg a公司产品;药敏纸片、M一H(Muel lre一Hinton)琼脂、肉汤培养基 和BL(Lur ia-Bertani)培养基为ox o记公司产品;引物合成及测序由Invir otgen公司完成。二、方法1.引物设计:部分参照文献,部分采用ir Pme rpe rmi e r5.0自行设计,见表1。根据整合子5保守区的整合酶基因序列设计I类、n类和l类整合子的特异性引物,用于整合酶基 因PCR(n Ie tg ras ege n。PeR);根据整合子可变区两侧的5端和3端保守区(e o n sev reds e脚e nt,CS)设计引物,用于整合子pCR(Inte脚nPe R)】。裹1扩增基因的C PR引物需扩增基因的名称引物序列(5一今3)预期扩增片段大小(bP)参考文献I类整合酶基 因4 08本研究1 1类整合酶基 因F:TTC GTGA TGC CTG CTTGTTR:C GC CCAGCTTCTGTA TGGF:C GTGCTGGAGGGAA AGACR:CA TGAC GGT A AGGGTGGGF:AGTG GGTGGC G AA TGAGTG207本研究1 1 1类整合酶基因R:TGTTCT TG T ATCG GCA G G T GI类整合子可变区F:C C CA TCC A A G C AGCA AG不定R:A AGCAGACTTGAC CTGA菌株,采用煮沸裂解法提取总DNA,再次检测整合子。4.整合子检测:采用整合酶基因C PR法,3种整合子 的检测均使用5 0闪反应体系:o rXb u f f er5卜l,dN TPsZX()林moFL,MgCI:2mmol/L,上下游弓物各10pmol,a Tq聚合酶1.S U,模板2卜l。I类整合酶基 因扩增的循 环参数为:9 5预变性5i mn;94305,50钓s,724 05,循环35次;最 后72延伸5mi n。n类和u I类整合酶基因扩增的退火温度分别为5 2和5 0,其余参数与I类的相同。所得PC R产物用含EB的2%琼脂糖凝胶进行电泳分析。5.整合子可变区扩增:所有菌株均采用整合子PCR法扩增其可变区。I类和n类整合子可变区扩增时所采用的体系同上,I类的循环参数为:9 5预变性5min;9 4305,554 Ds,72lX(),(每个循环依次延长5。),循环3 5次;最后 7 2延伸5mi n。n类的循环参数为:退火温度为5 6,其余参数与I类的相同。所得C PR产物用含EB的0.9%琼脂糖凝胶进行电泳分析。6.C PR产物测序及分析:I类和n类整合酶基因PCR产物各选1例直接测序;对整合子可变区P CR产物,160 0bp的片段选取8例测序,其余大小的片段选取2一5例进行测序。小于1。以 bp的片段采用产物直接测序,大于l以刃bp的片段或产物直接测序结果不理想时,采用T A克隆测序(将可变区扩增产物进行胶回收纯化后克隆至pM1 D8一T载体,经蓝白斑筛选和菌落PCR鉴定后测序)。所得测序结果均在e Gb na nk数据库中进行同源性比对。7.统计学处理:根据整合子检测结果,将大肠埃希菌和克雷伯菌分别分为整合子阳性组和阴性组,采用t Sa te7.0统计软件,iFsh ar确切概率法对整合子阳性组和阴性组菌株的药敏情况进行统计学分析。n类整合子可变区F,CG G G AT CC CG(;AC GGCA TGCACG A了叮CTA不定5结果R:GA T GCC A TC GCAAGTACGAG注:F:上游;R:下游;2.药敏试验:采用纸片扩散法测定1 8种抗菌药物药敏情况,见表2。质控 菌株为大肠杆菌A TCC25922和肺炎克雷伯菌A TCC70 0603。药敏判断标准按20 06年C比FNC C巧M lo o一5 16规定执行。3.细菌质粒DNA与总DNA模板制备:采用ome ga公司质粒抽提试剂盒,按试剂盒操作说明提取质粒,并做电泳分析,所得质粒D N A作为整合子检测和整合子可变区扩增的模板;对整合子阴性的1.6 1株大肠埃希菌和克雷伯菌的药敏结果:除亚胺培南10 0%敏感外,其余各类药物均有不同程度的耐药,耐药率从1 3.1%一9 5.1%不等。2.整合子检测及整合酶基 因扩增产物测序结果:均以细菌质粒DN A为模板,7 3.8%(45/6 1)的大肠埃希菌和克雷伯菌I类整合子阳性,其中,大肠埃希菌中的阳性率为 7 6.6%(3 64/7),克雷伯菌 中的阳性率为6 4.3%(91/4);2株大肠埃希菌n类整合子阳性;未检测到u I类整合子。I类和n类整合酶基因PCR产物各选取1例直接测序,结果显示,727表2整合子阳性组和阴性组大肠埃希菌药敏表型 比较抗菌药物整合酶基因阳性组(3 6株)整合酶基因阴性组(1 1株)阿莫西林/棒酸呢拉西林氨节西林呢拉西林2三哇巴坦头抱唾厉头抱他吮头抱肤厉头抱毗厉氨曲南亚胺培南链霉家庆大霉素阿米卡星左氧氟沙星诺氟沙星复方新诺明四环素抓霉素R%(株)16.7(6)97.2(35)97.2(53)2.8(l)58.3(21)31.9(5)63.9(23)4 1.7(15)27.8(10)0.0(0)80.6(29)61.1(22)2 2.2(8)86.1(31)88.9(23)88.9(23)86.1(31)41.7(15)I%(株)58.3(21)0.0(0)0.0(0)33.3(21)8.4(3)5.5(2)27.8(10)13.9(5)27.8(01)0.0(0)19.4(7)2.8(l)11.1(4)2.8(l)0.0(0)0.0(0)0.0(0)8.3(3)R%(株)0.0(0)xZ值6.2936.9573.3462.9773.5592.5312.7043.3只1.892/7.8 8610.153尸值7(88(9l(l4(40.0460.50 30.()670.2260.1660.月430.1140.1920.4031.(XX)0.()5X0.X】50.2310.刃60.(洲)20.(洲)10.2500.010勺,且Q了O门zn八,、0.0(036.4(427.3(36 19 59 05 31 2 1 4.二户J4 60OJ凡JQO产、气O口,乙9.1(l0.0(036.4(49.1(l0.0(045.5(545.5(59.1(l54.5(60.0(0)I%(株)36.4(4)9.1(l)0.0(0)9.1(l)0.0(0)0.0(0)45.5(5)0.0(0)27.3(3)0.0(0)63.6(7)0.0(0)9.1(l)0.0(0)0.0(0)0.0(0)0.0(0)0.0(0)注:.R%:耐药率;I%:中介率;S%(敏感率)二1一R%一I%(省略)扩增片段大小分别为 4 08 bp和20 7bp,与预期扩增片段大小相符,经 比对,与e Gb na nk数据库中的I类和n类整合酶基因的同源性均为10 0%。1 6株I类整合子阴性菌株的总DN A整合子检测均为阴性。3.整合子可变区扩增及测序结果:整合酶基因PCR阴性的菌株,整合子可变区PCR亦为阴性。I类整合酶基因阳性 的菌株,8 8.9%(4 0 4/5)整合子可变区扩增阳性,共 扩 增出 4 5个 片段,从15 0-2 80 0bp:150bp(3例)、60 0bp(5例)、70 0bp(4例)、160()bp(17例)、170 0bp(3例)、2 200bp(1例)、28X()bp(2例)、60 0bp+10 00bp(l例)、6 00bp+16X()bp(l例)、10 00bp+160 0bp(1例)、160 0bp+2 00 0bp(2例),部分I类整合子可变区扩增产物电泳图(N Jll s一1 23)见 图1。2株1 1类整合酶基因阳性菌株,有1例检出了整合子可变区,大小为2Zo ob P。I类整合子可变区PCR产物测序结果:巧0 bp的片段中无 耐药基因,但含有整合子5保守区和3保守区的骨架结构;60 0bp的片段中含有di f.Z d基因;70 0b P的片段中含有df rV基因;lXX)bp的片段中含有a adZ A基因;160 0bp的片段中含有d f r1 7一a adS A基因;170 0bp的片段中含有d f rx I I一。f r F一a adZ A基 因,2自 叉)bp含 有a a c 6一Ib一cm认1-vi a ra nt基因,22X()bp的 片段中含 有aae4 A一eatB S-韶dA I基因,2 80 0坤的片段含有a adB一c a卜b la ox al。-a ad AI基因,同源性均为 9 9%一10 0%。n类整合子可变区2 20 0bp的片段含有df rA I一sa tl.aadA I基因,同源性为9 9%。1234567891011.5 0()X X()5 0()0 0 05 0 01:50 0bp D N A分子标准;2一1 0:分别为南京地区临床分离菌株(NJ115一123);11:阴性对照圈11类整合子可变区扩增产物电泳图几乙0口甘OJ,凡乙八甘曰.人.人橄遨0123456789101 1 12 13 141516耐抗,药物种效圈2整合子 阳性与整合子阴性菌株耐抗 菌药物数的比较4.整合子与耐药和多药耐药的相关性分析结果:对大肠埃希菌的I类整合子阳性组和阴性组 的药敏情况(耐药、中介、敏感)进行分析后显示:阿莫西林/棒酸、呱拉西林、链霉素、庆大霉素、左氧氟沙星、诺氟沙星、复方新诺明、四环素和氯霉素在整合子阳性组的耐药率明显高于整合子 阴性组,并具有统计学意义;氨节西林、头抱唾肪、头抱他吮、头抱峡厉、头抱毗肪、氨曲南和阿米卡星在两组间的差别虽无统计学意义,但在整合子阳性组的耐药率均高于整合子阴性组。见表2。对克雷伯菌的I类整合子阳性组和阴性组的药敏情况(耐药、中介、敏感)进行分析后显示:链霉素和庆大霉素在整合子阳性组的耐药率明显高于整合子阴性组,并具有统计学意义;呱拉西林、头抱唾肘、头抱他吮、头抱吠肘、阿米卡星、左氧氟沙星、诺氟沙星、复方新诺明和四环素在两组间的差别虽无统计学意义,但在整合子阳性组的耐药率均高于整合子阴性组。见表3。整合子与多药耐药关系见图2:耐抗菌药数在0一5个时,均为整合子阴性的菌株;在1 2一1 6个时,均为整合子阳性的菌株。讨论整合子是近年来新发现的可移动基 因元件,可捕获和整合细菌的耐药基因,在细菌耐药性 的传播和扩散中起着至关重要的作用,根据整合子5保守区整合酶基 因同源性的差异,可将整合子分为四类困。既往研究在大肠埃希菌中发现了I类和n类整合子,在克雷伯菌中发现了I类和u I类整合子,而 W类整合子是在霍乱弧菌中被发现的,故本研究设计了I类、n类和l类整合酶基因的特异性引物,来检测大肠埃希菌和克雷伯菌中整合子的分布。本研究采取 的整合酶基 因PCR法来检测整合子是可靠的。在有些研究中,也采用整合子PCR法来检测整合子4,.,但笔者认为整合酶基因PcR法更敏感、更可靠,因为整合子PCR法来检测整合子较易产生假阴性,原因有:(1)PCR扩增片段的理想长度为250 0bp,而整合子中插入的基 因盒可能会大于这个长度;(2)少数I类整合子不含有3保守区。本研究在7 3.8%(4 5 6/l)的大肠埃希菌和克雷伯菌中检出I类整合子,在2株大肠埃菌中检测到n类整合子,可见,I类整合子在大肠埃希菌和克雷伯菌中分布广泛。世界各地关于整合子的检出率也不尽相同,台湾e hang等,在52%(54/l以)的临床分离的大肠埃希菌中检 出I类整合子;澳大利亚学者Jone。等 0在72.5%(37乃l)的临床分离的克雷伯菌中检出I类整合子;美国学者o Gld se ti n等川收集了55 5株分离自禽类和动物的肠杆菌科细菌,结果I类、n类和1 1 1类整合子的阳性率分别为4 6%、6%和9%。本研究中整合子的检 出率略高于既往研究,可能的原 因有:(l)本研究人选菌株以耐药及多重耐药菌为主;(2)各地区抗生素使用程度及不合理使用比例的不同而引起的地区性差 异;(3)随着时间的推移,临床分离菌株中整合子的检出率有上升趋势”;(4)本研究采用的整合酶基因表3整合子阳性组和阴性组克雷伯菌药敏表型比较抗菌药物整合酶基因阳性组(9株)整合酶基 因阴性组(5株)阿莫西林/棒酸呱拉西林氨节西林呱拉西林/三哇巴坦头抱唾厉头抱他陡头抱肤厉头抱毗厉氛曲南亚胺培南链霉素庆大霉素阿米卡星左氧氛沙星诺氟沙星复方新诺明四环素抓霉素R%(株)33.3(3)lX().0(9)lX().0(9)55.6(5)8.89(8)33.3(3)1X().0(9)55.6(5)6 6.7(6)0.0(0)77.8(7)lX().0(9)33.3(3)55.6(5)6 6.7(6)6 6.7(6)6 6.7(6)88.9(8)I%(株)11.1(l)0.0(0)0.0(0)33.3(3)11.1(l)22.2(2)0.0(0)11.1(l)33.3(3)0.0(0)1 1.1(l)0.0(0)11.1(l)0.0(0)22.2(2)0.0(0)22.2(2)0.0(0)R%(株)4 0.0(2)80.0(4)lX().0(5)6().0(3)80.0(4)0.0(0)80.0(4)80.0(4)80.0(4)0.0(0)0.0(0)0.0(0)0.0(0)4().0(2)6().0(3)20.0(1)4().0(2)lX().0(5)I%(株)4().0(2)0.0(0)0.0(0)2 0.0(1)0.0(0)6().0(3)2 0.0(1)0.0(0)0.0(0)0.0(0)80.0(4)0.0(0)0.0(0)20.0(l)20.0(l)20.0(l)6 0.0(3)0.0(0)犷值尸值2.24 01.9 39/0.3892.3852.9661.9391.0543.547/8.33814.(城 兀l3.1 1 11.9700.2073.7332.2400.5980.4 130.3571.(洲 洲)0.8230.60 40.2330.3570.7480.2(洲)1.洲)0.以】5O,砚X)10.3260.5280.9010.1610.5450.439PCR法敏感性高。从药敏表型上来看,整合子与大肠埃希菌和克雷伯菌的耐药和多重耐药有关,即整合子阳性菌比整合子阴性菌更容易产生耐药,而且以氨基糖昔类抗生素在两组间的差异尤为明显。进一步地,整合子与多药耐药也具有相关性,携带整合子 的菌株更容易表现为多重耐药,理 由:整合子阴性组平均每株菌耐药个数为5.9个,整合子阳性组高达o r.2个。从基 因型上来看,整合子与大肠埃希菌和克雷伯菌的耐药和多重耐药也有关。在I类整合子可变区中检出了多种基因盒,以含有编码对氨基糖昔类和磺胺类抗生素耐药的基因为主,这与耐药表型上链霉素、庆大霉素、复方新诺明在整合子阳性组的耐药率明显高于整合子阴性组的结果相一致,并发现一种在大肠埃希菌和克雷伯菌中广泛流行的I类整合子,占4 6.7%(2 14/5),该型整合子携带d f r17-a adS A型基因盒,从而造成携带该型整合子的菌株对氨基糖昔类和磺胺类抗生素耐药;在n类整合子可变区中检出d斤A l一sa tl一胡dA I基因盒,分别编码对甲氧节吮、链丝菌素和链霉素的抗性,这与国外文献报道一致”2,这可能是由于1 1类整合酶基因功能不全导致的整合子 的基因盒相对固定汇”,甲氧节咤和链霉素曾在临床上广泛使用,现已较少使用,其耐药基因的存在似乎是菌株对抗生素选择压力适应而在基因组中留下的“记忆”川。在I类和n类整合子中可见整合两种或三种耐药基 因的整合子,从而造成携带该整合子的菌株表现为多重耐药。在本研究中左氧氟沙星、诺氟沙星在整合子阳性大肠埃菌组 的耐药率明显高于整合子阴性组,但并未发现唆诺酮类相关耐药基因位于整合子可变区,需进一步研究阐明原因。本研究在国际上首次在肺炎克雷伯菌和产酸克雷伯菌携带的整合子中分别检出di fZd型和d f rV 型耐药基因(A9 Y6 880 7和A9 Y6 880 8),这两种亚型的耐药基因以前只在大肠埃希菌 中报道过,现又在肺炎克雷伯菌和产酸克雷伯菌 中分别检出,证 实了di fZd型和d f rV型耐药基因在大肠埃希菌和克雷伯菌间的传播,很可能是由于整合子捕获耐药基因,并借助于质粒从而在不同种的细菌之间传播。本研究中的a adZ A、d f r妞一of r F一a adZ A和d f r17一a adA S基 因盒均在大肠埃希菌和克雷伯菌中检出,也间接证实了这些基因盒在这两种菌中的传播。可见,整合子在大肠埃希菌和克雷伯菌的多重耐药和耐药传播中发挥了重要作用。因此,加强抗菌药的合理使用,积极研究临床分离菌株中整合子的种类和耐药基因的构成,对了解细菌耐药进而控制细菌耐药有重要意义。参考文献1Sto ke sHW,Ha l lRM.An ov el f am 11 yo fp otentia l lym obileD N Aelem en tse n eo din gsie t,日衅e近e罗ne一integ旧tionf unctions:inte脚ns.Mol Mieo rbio l,1989,3:166 9一1683.2Ko elea m nJG,Sto ofJ,Va nDe rBi jl MW,eta l.Ideni ti fei a to no fe Pid e而es画nsO fAeine o tba cterba um a nniibyinteg r 朗e,n ePC R.JClinMie功bio l,2X()l,39:8一13.3o GldsteinC,肠eM D,Sa n che zS,eta l.In eide ne eo fela ssla nd Zinteg r 朋e sinei lniea la nde on u nen耐ba ce tira加mliv e so c tk,c om P 画o na nima ls,a nde xoi te s.An t i而eo rbA罗ntsC hemoh te r,2X()1,45:723一26.4玩v es queC,Pie玩L,压功s eC,a ta l.PCRmappingO finte,n。花v ea lsv s eea lzno耐eom bina tio n sfOe rsis切口e eg ene o.Anti而e拍bAge nstCheo mh te r,1995,39:185一191.5确 飞ie tP A,Melv e rCJ,Ra wlins onWD.Inte脚noa ndg en eet tesinh tee nt的ba ce ti ra cea e.Ani t而eo rbAg entsChemothe r.2X()l,45:2658-2 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