万方数据万方数据62中国生物工程杂志ChinaBiotechnologyV01．25No．520052结果2．1MAP30基因的克隆及鉴定因为MAV30基因没有内含子，其mRNA与DNA是一致的，故以苦瓜总DNA为模板，MAP301、MAP302为引物，通过直接PCR扩增MAP30基因。PCR扩增以及克隆载体的酶切鉴定结果分别见图1、图2。图1PCR扩增MAP30基因Fig．1PCRamplificationofMAP30gene1：DNAmarkerDL2000；2：Negativecontrol；3，4：PCRproductsatthetempkconcentrationof1，lOng，respectively图2克隆载体pGEM-T-MAP30的双酶切鉴定Fig．2IdentificationofpGEM-T-MAP30byenzymedigestionEcoRI，妇DIM：DNAmarkerDL2000；+：MAP30genefromPCRproduct；一：pGEM—T—easyvector；1—6：pGEM-T-MAP30从图1可以看出，通过PCR扩增到～条长约800bp的目标带，与实验拟扩增条带的大小一致。而从图2可知，克隆载体pGEM—MAP30用＆嘏I和XhoI双酶切得到的片段与我们插入的片段(约800bp)大小一致，初步证明克隆载体已构建成功。测序结果表明，所克隆到的MAP30基因与GenBank上公布的序列完全一致。2．2表达载体的构建及工程茵的筛选将双酶切得到的MAP30片段与pET-30a载体片段连接，构建成含有N端6his—tag的融合表达载体pET．30a．MAP30。表达载体转化大肠杆菌L21(DE3)，然后通过菌落PCR和SDS．PAGE筛选B121(DE3)／pET．30a—MAP30工程菌。菌落PCR及SDS-PAGE结果分别如图3、图4。图3菌落PCR鉴定阳性克隆Fig．3IdentificationofrecombinantbycloningPCR1：DNAmarkerDL2000；2：Negativecontrol；3：PCRproductsofpET-30a—MAP30；4～6：PCRproductsofthreerandomclones图4BL21(DE3)／pET-30a．MAP30表达分析Fig．4ExpressionanalysisbySDS-PAGE1：Proteinmolecularweightmarker；2：Controlwithoutinduction；3～5：ThreerandomclonesindUCedbylmmol／LIPTGfor4h；6：BL21(DE3)／pET-30ainducedby1mmol／LIPTGfor4h从图3可以看出，随机挑取的3个重组克隆通过PCR可以扩增出目的片段，初步证明表达载体已构建成功。然后把筛选到的工程菌B121(DE3)／pET一30a．MAP30在30cc条件下、1mmol／LIPTG诱导4h，取菌体进行SDS．PAGE，在35kDa处清晰可见诱导表达条带，相对分子质量与预计的一致(图4)。2．3最佳诱导温度分析工程菌分别于26、28、30、32和34℃下培养，再经1mmol／LIPTG诱导4h，然后取菌体进行SDS．万方数据林育泉等：苦瓜MAP30蛋白基因克隆、表达及其抗肿瘤活性研究63PAGE分析。如图5所示，重组蛋白在30。C...
