专业技能训练（分子生物学部分）实验二质粒DNA的提取与纯化一、实验原理:质粒多为一些双链、环状的DNA分子，是独立于细菌染色体之外进行复制和遗传的辅助性遗传单位。质粒是进行分子生物学实验操作，进行遗传工程改良物种等工作时最主要的DNA载体。提取质粒的基本步骤分为三步：①细菌的培养和质粒的扩增，②细菌菌体的裂解，③质粒DNA的纯化。本实验采取的菌体裂解方法为碱解法，质粒纯化方法为梯度离心法。二、材料与试剂1、材料：大肠杆菌2、仪器：超净工作台，培养箱，摇床，恒温水浴锅，台式离心机，取液器一套，低温冰箱，电泳仪，水平电泳槽，紫外观测仪等3、试剂：SolutionI高压灭菌，4℃保存；SolutionII：现配现用；SolutionIII：高压灭菌，4℃保存；异丙醇/氯仿（24:1）无水乙醇，预冷70％乙醇，预冷TE缓冲液SolI(100ml)SolII(100ml)SolIII(100ml)25mMTris-HCl(pH8.0)2.5mlof1Mstocksoln.1%SDS1g3MKAc29.45g10mMEDTA2.0mlof0.5MStocksoln.0.2NNaOH0.8g11.5%HAc11.5ml50mMGlucose0.9g三、操作步骤1.接种大肠杆菌到3mlLB+培养基中，37oC培养过夜；2.取3ml培养液到1.5ml离心管，离心10,000,2min.用真空吸管吸掉上清，再稍微离心后，吸干上清；（本次实验提前备好）3.用100μlSolI充分重悬；4.加入200μlSolII后温和翻转3-5次混合（变透明），冰中放置5min（时间不能超过5min）；5.加入150μlSolIII后温和翻转混合，出现沉淀，冰中放置5min；6.4oC离心12,000rpm，5min，后上清移至新离心管；7.加入500μl氯仿/异戊醇（24：1）,混合几次；8.4oC离心12,000rpm,5min后，上清（约400μL）移至新离心管；9.加入800μl冷（-20oC）乙醇，振荡混合，4oC离心12,000rpm,5min，去上清；10.加入500μl70%冷（-20oC）乙醇，稍微混合，4oC离心12,000rpm,5min，去上清；11.常温干燥15min；12.用20μLTE缓冲液溶解；13.电泳检测提取DNA及其酶解产物的质量。四、结果与分析1.观察提取的质粒DNA样品的浓度和纯度；
