Western实验原理免疫印迹（WesternBlotting）的基本原理及应用免疫印迹是一个用于蛋白质分析的常规技术，在电场的作用下将电泳分离的蛋白从凝胶转移至一种固相支持物，然后利用抗原-抗体的特异性反应，从蛋白混合物中检测出目标蛋白，从而定量或定性的确定正常或实验条件下细胞或组织中目标蛋白的表达情况。Westernblotting还可用于蛋白-蛋白、蛋白-DNA和蛋白-RNA相互作用的后续分析，作为一种廉价、便捷、可靠的研究工具，将与质谱和蛋白质芯片等技术一起在蛋白质组时代发挥重要作用。WesternBlotting的protocol种类繁多，但大同小异，基本为上述几个步骤。要得到一个完美的实验结果，不仅需要优质的抗体，同时应对整个实验流程和体系进行严格的质量控制，才能最终达到你的实验目的。影响免疫印迹成败的一个主要因素是抗原分子中可被抗体识别的表位性质。因为涉及到抗原样品的变性，只有那些识别耐变性表位的抗体可以与抗原结合。多数多克隆抗体中或多或少含有这种类型的抗体，所以在免疫印迹中常选用多克隆抗体。第二个影响因素是蛋白原液中抗原的浓度。一些表达量低的蛋白在免疫印迹前常需要通过免疫沉淀，亚细胞分离等手段富集。Western实验步骤基本实验步骤一、样品制备对于WesternBlotting实验而言，样品处理是关键步骤之一，获得的蛋白样品必须均质、可溶，并解离成单个多肽亚基，且尽量减少相互间的聚集，使其最终仅依赖本身的分子量大小进行分离。当目标蛋白的含量很低时，需要选取目标蛋白含量较高的组织或细胞器（如核抽提物），或者通过免疫沉淀等方式进行富集。通常样品有重组蛋白、细胞和组织等。1.样品收集1）培养的细胞贴壁和悬浮细胞收集方式不同，细胞裂解液种类各异，推荐含SDS的凝胶加样缓冲液裂解，煮沸即可。2）动物组织与细胞不同，组织块由于体积较大，须预先经破碎匀浆处理。2．样品定量样品电泳前需测定蛋白浓度，以便保证上样量一致，有利于后续定量或半定量分析。常用的蛋白质浓度测定方法有好多种，其灵敏度和所需时间不同，且不同的方法会受不同干扰物质的影响，实验者可根据样品制备方法（裂解液成分、去垢剂和还原剂种类等）自行选择。几种蛋白质浓度测定方法比较优点缺点Bradford法迅速、灵敏对各种纯化蛋白质反应不同BCA法简单、干扰少耗时Lowry法不同蛋白差别小干扰多，较慢注意事项：a.应尽量避免引入影响后续定量的杂蛋白（如细胞培养液、蛋白酶抑制剂等）及其他干扰物质；b.样品浓度应适中，1×SDS凝胶...
