沈健2015.7.10免疫印迹（Westernblot）定义和基本原理WesternBlot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测“”“”物是蛋白质，探针是抗体，显色用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。WB的实验基本流程主要内容1.收集蛋白样品(Proteinsamplepreparation)2.电泳(Electrophoresis)3.转膜(Transfer)4.封闭(Blocking)5.一抗孵育(Primaryantibodyincubation)6.二抗孵育(Secondaryantibodyinucubation)7.蛋白检测(Detectionofproteins)一、收集蛋白样品(Proteinsamplepreparation)1.蛋白样品选择是否合适。(组织细胞的表达特异性)2.蛋白样品的处理时候合适。(刺激效果是否达到)3.蛋白样品的验证是否可靠。(包括浓度，样品有没有降解等)样品制备中用到的试剂甘油：主要起沉降作用，让你在上样的时候不飘到孔外。SDS：导致蛋白质变性，易于蛋白结合，形成易溶于水的复合物。β-mercaptoethanol：作为还原剂，打开二硫键，使蛋白质的四级或三级结构被破坏，使蛋白成为寡氨基酸链。以与二硫苏糖醇（DTT）或三(2-甲酰乙基)膦盐酸盐（TCEP）互换使用溴酚蓝：作为一种指示剂，成蓝色，只是我们样品跑胶的一种程度。公司相对应的产品蛋白定量系列编号名称规格价格BD0028BioepitopeRBicinchoninicAcidProteinAssayKit500次380元BD0029BioepitopeRBradfordProteinAssayKit500次150元蛋白提取编号名称规格价格BD0030NuclearandCytoplasmicExtractionKit50T580元BD0031RIPAtotalproteinextractionlysisbuffer100T280元电泳原理：在一定的电场强度下，让带电的蛋白分子在电场下通过三维网状结构的胶，由于蛋白分子的大小不同，质量不同，导致它的迁移率不同，最终跑胶介绍会呈现分子量的一个梯状条带，分子量大的跑的越慢。浓缩胶：浓度比较低（4%丙烯酰胺-甲叉双丙烯酰胺），里面的孔径也比较大，所有的蛋白都能够在进入分离胶之前在同一水平线上分离胶：浓度比较大（>10%），里面胶孔径也比较小，这样施加电压的时候小的蛋白可以穿过孔跑到下面去，而分子量大的蛋白就可能被拦住，所以能呈现分子量不同的梯度。MARK:已...
