成功完成WesternBlot检测，必须满足4个条件：1.凝胶洗脱：转移期间蛋白质必须从凝胶中洗脱出来，如果蛋白质还截留在凝胶中，将无法在膜上进行分析2.吸附到膜上：在转移过程中蛋白质必须吸附到膜上，如果蛋白不吸附，将无法在膜上进行分析3.处理期间仍截留在膜上：在转移后的处理过程中蛋白质必须保持吸附在印迹膜上4.处理过程中可接近：被吸附的蛋白质必须能够与检测试剂接触，如果蛋白质被掩盖则无法检测成功进行WB检测，则设置合适正确的对照是必不可少的，只要正确设置了这些对照，即可快速和准确的找到WB的问题所在，并保证实验结果的准确性和特异性！一般需要设置的对照如下：阳性对照：明确表达检测蛋白的组织或细胞，用于检测抗体的工作效率阴性对照：明确不表达检测蛋白组织或细胞，用于检测抗体的特异性二抗对照：不加一抗，用于检测二抗的特异性内参对照：检测标本的质量和二抗系统空白对照：不加一抗和二抗；用于检测膜的性质和封闭的效果WB检测基本过程1、获取细胞或组织裂解物1)根据检测蛋白的位置选择合适的裂解buffer：蛋白位置推荐buffer全细胞NP-40orRIPA胞浆（可溶性蛋白）Tris-HCl胞浆（骨架结合蛋白）Tris-Triton膜蛋白NP-40orRIPA核蛋白RIPAor核蛋白提取试剂盒线粒体蛋白RIPAor线粒体分离试剂盒亦可购买商业化的蛋白提取试剂盒来保证标本制备的质量2)选择合适的蛋白酶抑制剂，避免蛋白降解，从而保证检测的准确性！2、蛋白定量常用的蛋白定量方法：Bradfordassay,Lowryassay或BCAassay。定量后，可根据情况将标本保存在-20°C/-80°C备用，进行免疫沉淀（IP）或者直接进行电泳分离蛋白3、电泳分离蛋白质根据待测蛋白状态确定电泳条件：待测蛋白状态凝胶条件上样buffer电泳bufferReduced-Denatured还原，变性含β-巯基乙醇或DTT，含SDS含SDSReduced-Native还原，不变性含β-巯基乙醇或DTT，不含SDS不含SDSOxidized-Denatured不还原，变性不含β-巯基乙醇或DTT，含SDS含SDSOxidized-Native不还原，不变性不含β-巯基乙醇或DTT，不含SDS不含SDS根据待测蛋白分子量大小确定凝胶浓度蛋白分子量（kDa）凝胶浓度（％）4-402012-451510-7012.515-1001025-20084、转膜根据不同的检测目的和待测蛋白的特性，选择合适的膜类型。常用的转移膜类型有：PVDF膜、硝酸纤维素膜（NC膜）和尼龙膜，其中PVDF和NC膜的使用频率最高。各种膜的技术参数及比较如下：PVDF膜NC膜尼龙膜灵敏度和分辨率高高高背景低低较高蛋白结合能力100-200ug...
