原代细胞的分离与培养1.实验原理原代培养是指由体内取出组织或细胞进行的首次培养，也叫初代培养。原代培养离体时间短，遗传性状和体内细胞相似，适于做细胞形态、功能和分化等研究。较为严格地说是指成功传代之前的培养，此时的细胞保持原有细胞的基本性质，如果是正常细胞，仍然保留二倍体数。但实际上，通常把第1代至第10代以内的培养细胞统称为原代细胞培养。体外将动物某组织，经酶法或机械处理法分离成单细胞，并在合适的培养基中筛选出特定细胞，使得目的细胞得以生存、生长和繁殖，称为原代细胞分离。分离所得的细胞要经过鉴定才可用于实验。解螺旋http://www.helixlife.cn/2.实验目的分离获得原代细胞3.实验材料2.1主要试剂新鲜组织、培养基、血清、胰蛋白酶、生长因子等2.2主要仪器仪器名称来源型号生物安全柜苏净安泰BSC-B000IIA2二氧化碳培养箱Thermo311离心机上海卢湘仪公司TP25-ws显微镜OlympusCKX41酶标仪Epoch波长595nm4.实验步骤4.1部分干细胞，如骨髓间充质干细胞，推荐购买，原代不好养，鉴定也不易。4.2全骨髓贴壁法分离培养BMSC（骨髓基质干细胞）及成骨诱导分化[11]4.2.1细胞分离1.在1.5月大组的4组大鼠中每组随机挑选2只进行骨髓间充质干细胞提取实验。在处死大鼠后，将大鼠浸泡于75%乙醇中约10-15min。2.在超净台内无菌条件下迅速取出双侧股骨，浸泡在无菌PBS中。用含有500u/ml青链霉素的PBS冲洗股骨3遍。解螺旋http://www.helixlife.cn/3.去掉股骨两侧的骨骺端，暴露骨髓腔，用5ml注射器吸取5ml细胞培养液，将针头插入一侧骨髓腔，用细胞培养液冲洗骨髓腔，冲洗液收集在一60mm细胞培养皿内，之后再用注射器吸取冲洗液，将针头插入另一侧骨髓腔冲洗，如此反复数次，直至绝大部分骨髓被冲出为止。此时所得冲洗液即为股骨骨髓细胞悬液。4.用注射器小心吸吹细胞悬液数次，将细胞充分混勾。取20ml细胞悬液，加入180ul生理盐水，之后抽取20ul滴入细胞计数板内，计算细胞浓度，之后调整接种密度，要求最终接种密度在2–8x106范围内。5.将培养皿放置在细胞培养箱（37.5℃，5%CO2）内常规培养。48小时后半量更换细胞培养基，之后每72小时全量更换细胞培养基，直至细胞铺满约80%培养皿，此时所得贴壁细胞即为骨髓间充质干细胞。4.2.2细胞传代细胞传代：小心吸出细胞培养液，用PBS冲洗细胞2次，之后加入0.25%胰蛋白酶溶液3ml，消化细胞3分钟，显微镜下观察细胞，至细胞之间不再连接成片、多数细胞胞质回缩。吸弃胰蛋白酶溶液，加入细...
