THEPOLYMERASECHAINREACTION（PCR）baishasha@gzucm.edu.cn聚合酶链式反应（PCR）概念聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction），即PCR技术，是一种由引物介导，利用DNA聚合酶在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法。也叫基因扩增技术。PCR技术对目的基因进行大量扩增，具有高灵敏、高特异、可重复、费用低、操作简便、对待检材质要求低等特点，是分子生物学研究中应用最为广泛的技术之一。发展历程1971年提出PCR技术雏形1983年KaryMullis发明PCR技术1987年获得专利1993年获得诺贝尔化学奖HowtomakecopiesofastrandofDNAyouareinterestedin？基本原理试管中进行的DNA复制反应，依据DNA半保留复制的机理；体外DNA分子于不同温度下可变性和复性的性质；通过人为控制体外合成系统的温度，使双链DNA变成单链，单链DNA与人工合成的引物退火，DNA聚合酶使引物沿着单链模板延伸为双链DNA。标准的PCR反应体系a)Template102-105copiesb)Primer0.1-1.0umol/Lc)dNTP0.2mmol/Ld)DNApolymerase2.0-2.5Ue)10×buffer10ul(Mg2+1.5-5.0mmol/L)f)ddH2Oupto100ul常规PCR的反应过程•Step1：•双链DNA热变性•94℃•Step2：•引物与模板单链DNA退火•55℃-65℃•Step3：•DNA的聚合延伸反应•72℃（Step1～3称为一个循环，如此循环往复25～30次）高温变性低温退火中温延伸PCR扩增的理论公式总的拷贝数＝2n“长产物”拷贝数＝2n“短产物”拷贝数＝2n-2n其中，n是循环数Cycle:1234562030DNACopies:2481632641048576230TargetCopies:002822521048536约109PCR的扩增效率理论上：Y＝2n实际上：Y＝(1+X)n其中，Y代表DNA片段扩增后的拷贝数，X表示平均每次的扩增效率，n代表循环次数。Whathappened？a)前期b)指数增长期c)平台期平台期来临的原因1.dNTP的消耗2.TaqDNA聚合酶的活性下降3.产物二聚体的产生4.非特异性的扩增影响PCR的主要因素PCR反应五要素●DNA聚合酶●引物●Mg2+和Buffer●dNTP●模板DNA1.DNA聚合酶的忠实性PCR突变比率：F=1-e-bfd其中，b靶序列长度，f错误率，d倍增次数。错误率是指每渗入一个碱基对时，碱基的错配率⑴Klenow片段最早使用的酶！1993年，Mullis获Nobel化学奖缺点：1.Klenow酶不耐高温，90℃会变性失活，每次循环都需重新添加2.引物链延伸在37℃下进行，容易发生模板和引物之间的碱基错配，其PCR产物特异性较差，合成的DNA片段不均一⑵TaqDNAPolymerase目前有两种TaqDNA聚合酶供应：天然酶：从栖热水生杆菌中提纯基...
