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技术与方法生物技术通报BIOTECHNOLOGY BULLETIN2023,39(8):137-147收稿日期：2023-02-19基金项目：国家重点研发计划（2022YFD1300701），农业科技创新工程（cxgc-ias-16）作者简介：赵思佳，女，硕士研究生，研究方向：食品微生物；E-mail:sijia_通讯作者：田健，男，博士，研究员，研究方向：蛋白分子设计；E-mail:；张杰，男，博士，研究方向：微生物代谢工程；E-mail:赤藓糖醇（erythritol）在自然界中分布广泛，是一种天然甜味剂、渗透保护剂。它存在于梨、葡萄等水果，蘑菇、甜菜等蔬菜，啤酒、清酒等饮料，酱油等发酵食品，海藻以及人和动物体液中1。赤代谢工程改造毕赤酵母生产赤藓糖醇赵思佳1 王晓璐2 孙纪录1 田健2 张杰2（1.河北农业大学食品科技学院，保定 071000；2.中国农业科学院北京畜牧兽医研究所动物营养学国家重点实验室，北京 100193）摘 要：本研究旨在以毕赤酵母为底盘细胞构建赤藓糖醇生产菌株。通过调控糖酵解途径中磷酸果糖激酶基因 pfk 的表达，敲除副产物阿拉伯糖醇和核糖醇生产相关基因，过表达不同来源的 4-磷酸赤藓糖磷酸化酶、赤藓糖还原酶和糖醇磷酸酶，构建毕赤酵母赤藓糖醇生产菌株，对过表达戊糖磷酸途径关键酶转酮酶（TKL）、磷酸核酮糖差向异构酶（RPE）及赤藓糖还原酶对赤藓糖醇产量的影响也进行了探究。结果表明，过表达酿酒酵母来源的糖醇磷酸酶基因 pyp1 及大肠杆菌来源的 4-磷酸赤藓糖磷酸化酶基因 yidA 的工程菌株 C8 具有赤藓糖醇生产能力，摇瓶发酵产量为 30 mg/L；进一步过表达 tkl 和 rpe 后，菌株 C10 摇瓶发酵产量提高约 40 倍，达到 1.2 g/L，高密度发酵产量为 10.6 g/L；赤藓糖还原酶的过量表达并没有提升赤藓糖醇的产量，反而提高了副产物的产量。本研究首次在毕赤酵母中成功构建了赤藓糖醇合成通路，为改造毕赤酵母高效生产赤藓糖醇及其他高价值化合物奠定基础。关键词：赤藓糖醇；毕赤酵母；代谢工程；发酵DOI:10.13560/ki.biotech.bull.1985.2023-0138 Modification of Pichia pastoris for Erythritol Production by Metabolic EngineeringZHAO Si-jia1 WANG Xiao-lu2 SUN Ji-lu1 TIAN Jian2 ZHANG Jie2（1.College of Food Science and Technology,Hebei Agricultural University,Baoding 071000;2.State Key Laboratory of Animal Nutrition,Institute of Animal Science,Chinese Academy of Agricultural Sciences,Beijing 100193）Abstract:The aim of this study is to construct an erythritol-producing strain using Pichia pastoris as the chassis cell.An erythritol-producing P.pastoris strain was developed by regulating the expression of phosphofructokinase gene（pfk）in glycolysis pathway,knocking out the genes associated with the production of by-products arabitol and ribitol,and overexpressing 4-phosphate erythrose phosphorylase,erythrose reductase and sugar alcohol phosphatase genes derived from different organisms.Next,we investigated the effects of overexpressions of erythrose reductase and two key enzymes transketolase（TKL）and ribulose-phosphate epimerase（RPE）involved in pentose phosphate pathway on the erythritol production.The results showed that strain C8 harboring pyp1 gene derived from Saccharomyces cerevisiae and yidA gene derived from Escherichia coli had the ability to produce erythritol.The erythritol production of the C8 strain in shake-flask fermentation was 30 mg/L.Furthermore,the overexpression of tkl and rpe genes enhanced the erythritol production of C10 strain by about 40-fold.The erythritol production of C10 reached 1.2 and 10.6 g/L in the shake-flask and high-cell-density fermentations,respectively.Further the overexpression of erythrose reductase did not cause the erythritol production increased,while caused the production of by-products increased.In this study,the erythritol synthetic pathway was successfully constructed in P.pastoris for the first time,which laid a foundation for engineering P.pastoris for efficient production of erythritol and other high-value compounds.Key words:erythritol;Pichia pastoris;metabolic engineering;fermentation生物技术通报 Biotechnology Bulletin2023,Vol.39,No.8138藓糖醇的口感、质地与蔗糖相似，甜度为蔗糖的60%-80%，热量仅为蔗糖的 5%，在多元醇中对动物机体的副作用最小2-4。赤藓糖醇能被小肠快速吸收，但 90%不参与人体代谢，且与尿液一起排出体外，不改变体内血糖和胰岛素水平，被认为是一种零热量、安全性高的甜味剂，受到了糖尿病患者和减肥人群的青睐。除了作为功能性甜味剂外，赤藓糖醇还有一定的抗氧化特性，可作为自由基清除剂5。此外，它还具有保护肝脏、吸湿性低、热稳定性好、溶解热低、耐受量高、防龋齿、加工特性优良等特点6。目前，赤藓糖醇被广泛应用于食品、医药、化工及化妆品等领域，用于制作牙膏、无糖食品、饮品、保健品以及药品7。据预测，2023 年全球赤藓糖醇的年产值可达 1.5 亿美元，相比 2017年提升了 1.9 倍8。天然的蔬菜、水果中赤藓糖醇的含量太低，直接提取的成本较高，故赤藓糖醇的生产方法主要是化学合成法和微生物发酵法9。化学合成法包括用金属或金属氧化物催化、用阿拉伯酸或核糖酸电解脱羧等方法，但这些反应过程需要高温、高压，生产成本高昂10。微生物发酵法主要是用真菌进行发酵生产赤藓糖醇，此外一些细菌如酒球菌（Oenococcus oeni）、明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）、旧金山乳杆菌（Lactobacillus sanfranciscensis）等也可以生产少量赤藓糖醇11-13。目前，被用于生产赤藓糖醇的菌属有：耶氏酵母属（Yarrowia）、假丝酵母属（Candida）、圆酵母属（Torula）、假酵母属（Pseudozyma）、丛梗孢酵母属（Moniliella）等14。常用的酵母菌包括丛梗孢酵母（Moniliella pollinis）、解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）、球头三型孢菌（Trichosporonoides oedocephalis）等15。基 于 M.pollinis 细胞裂解物的培养基可以使乙醇转化为赤藓糖醇，从而提高赤藓糖醇总产量，在甘蔗汁补料分批发酵 M.pollinis 时，获得了最大滴度为 94.9 g/L 的赤藓糖醇16。以粗甘油为原料、Y.lipolytica 野生型为底盘菌株，探究提高赤藓糖醇产量的方法，研究发现单独过表达 GUT1 的突变株 GUT1 表达量可以提高 11 倍，由于基因的协调作用，同时，过表达 GUT1、GUT2 粗甘油同化可以提高 1/3。过表达 TKL1 的菌株赤藓糖醇效价比对照菌株增加了48.1%，说明编码转酮醇酶的 TKL1 对于赤藓糖醇的合成起了重要作用。过表达 GUT1、GUT2 和 TKL1，敲除 EYD1 是生产赤藓糖醇的最佳组合，根据此组合获得的突变株 Y-11 在 5 L 生物反应器中赤藓糖醇产量达到了 150 g/L17。以 T.oedocephalis 为底盘菌株，敲除 HOG1 后在 200 g/L 葡萄糖和 0.3%柠檬酸条件下发酵 120 h，得到（69.120.19）g/L 赤藓糖醇，但当柠檬酸浓度增加到 0.4%时，赤藓糖醇的产量降低，说明较高浓度的柠檬酸可能会抑制细胞生长并影响代谢18。甲基营养酵母毕赤酵母（Pichia pastoris）易于遗传操作、在葡萄糖和甘油上能够快速生长、可以高细胞密度发酵以及在细胞内、外产生高水平异源蛋白质的能力使它成为一种有吸引力的多功能底盘细胞19。近年来，P.pastoris 已被广泛用作生产各种高价值生物活性化合物的高效细胞工厂，包括苹果酸20、脂肪酸21、肌醇22等。P.pastoris 作为一种耐高渗酵母菌，具有高产赤藓糖醇的潜力，但目前还没有赤藓糖醇在 P.pastoris 中合成的相关报道。本研究以 P.pastoris GS115 为出发菌株构建赤藓糖醇细胞工厂，分析糖酵解途径、戊糖磷酸途径碳代谢流改造及 4-磷酸赤藓糖磷酸化酶、糖醇磷酸酶、赤藓糖还原酶的过表达对 P.pastoris 中赤藓糖醇生产的影响，同时利用生物信息学结合代谢工程技术研究副产物阿拉伯糖醇和核糖醇合成关键基因，为高产赤藓糖醇 P.pastoris 工程菌株构建奠定基础。1 材料与方法1.1 材料所用菌株及质粒见附表 1。所用引物均由擎科生物合成（附表 2）。1.2 方法1.2.1 基因组编辑载体的构建 为了构建生产赤藓糖醇的 P.pastoris 菌株，并提高其产量，试验弱化了P.pastoris 自身的果糖-6-磷酸激酶 I 基因 pfk1、甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因（PAS_chr2-1_0437）；敲除了果糖-6-磷酸激酶 II 基因 pfk2，合成阿拉伯糖醇和核糖醇的基因 PAS_chr2-2_0019、PAS_chr4_0988、PAS_chr4_0754 和 PAS_chr1-1_0490；过表达自身转2023,39(8)139赵思佳等：代谢工程改造毕赤酵母生产赤藓糖醇酮酶基因 TKL1（PAS_chr1-4_0150），来源于酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的核酮糖-3-磷酸差向异构酶基因 rpe1 和去磷酸化酶基因 pyp1，来源于 E.coli 的去磷酸化酶基因 yidA，来源于里氏木霉（Trichoderma reesei）的赤藓糖还原酶基因 err1，来源于 Y.lipolytica 的 NADH 依赖型以及木兰假丝酵母（Candida magnoliae）的 NADPH 依赖型赤藓糖还原酶基因 er，经过组合，共构建了 7 个基因组编辑质粒（附表 1）。P.pastoris 基因组编辑质粒的构建参照前期已经建立的方法22。以重组质粒 p19-3-1-aox-Pgap1-pyp1 的构建为例：以 P.pastoris GS115 基因组为模板，扩增 aox 两侧各 1 000 bp 左右的 DNA 序列作为上下游同源臂，将上游同源臂与 p19-3-1 质粒连接，通过PCR 及 overlap PCR 获 得 small arm-Pgap1-pyp1-down arm 片段，利用同源重组试剂盒将该片段与 p19-3-1-up-arm 质粒连接，即获得 p19-3-1-aox-Pgap1-pyp1重组质粒。其他基因组编辑质粒的构建与之类似，不再赘述。1.2.2 重组毕赤酵母菌株的构建 共构建 11 个重组P.pastoris菌株。P.pastoris工程菌构建分为两部分：目的片段的敲入和抗性基因的敲除。构建方法参考文献22，简述如下：目的片段的敲入。利用限制性内切酶 Not I 酶切载体，将线性化的重组质粒转化 P.pastoris 菌株，经 30、30 min 复苏后，将转化后的菌液涂布于含Zeocin 抗性的 BMGY 培养基，30倒置培养 48 h。待单克隆出现后，利用克隆 PCR 和测序的方法验证目的片段的敲入情况。抗性基因的敲除。选取成功整合目的片段的菌株进行甲醇诱导，通过 mazF 毒性基因的表达结合同源重组将抗性标签敲除。甲醇诱导体系：5 mL YNB、45 mL ddH2O 和 500 L 甲醇。30诱导，每24 h 补加 500 L 甲醇。诱导 2-3 d 后的菌液梯度稀释涂布 BMGY 培养基，利用克隆 PCR 和测序的方法验证抗性标签的去除情况。1.2.3 外源基因在毕赤酵母中的表达 为了快速筛选外源基因，采用构建游离质粒，电转化 P.pastoris的方法，验证外源基因是否表达。基础表达质粒T-ARS-PGAP 是在 T 载体的基础上构建，含有能在 P.pastoris 中 自 我 复 制 的 ARS（autonomously replicating sequence）复 制 子，组 成 型 强 启 动 子PGAP，用于纯化的 His 标签，Ampicillin、Zeocin 抗性标记以及预留的多个酶切位点。筛选的目的基因包括来源于 S.cerevisiae 的 pyp1，来源于 T.reesei的 err1，来源于 Y.lipolytica 的 er（NADH）、ER10、ER25 和 JX885，来源于 C.magnoliae 的 er（NADPH），来源于 M.megachiliensis 的 er1、er3，经密码子优化后，由北京六合华大基因科技有限公司合成。yidA和 rpe1 分别以 E.coli 和 S.cerevisiae 的基因组为模板扩增获得。目的基因删除终止密码子，经过 PCR 扩增后，利用同源重组试剂盒连接到 T-ARS-PGAP 载体的 Hind III 和 Xho I 酶切位点，获得这些基因的表达载体（附表 1）。将含有目的基因的表达载体转化 P.pastoris C0菌株，挑取单克隆转化子，30培养 24 h。选择生长旺盛的菌株接种于 50 mL BMGY 培养基培养 24 h，然后，按 2%接种量转接于 200 mL BMGY 培养基，30、200 r/min培养48 h。将菌液于5 000 r/min离心，获得菌体，经液氮研磨，用 10 mL Tris-HCl（pH 7.4）重悬，12 000 r/min 离心 10 min，取上清。含 His 标签的蛋白通过磁珠法纯化（His-tag 蛋白纯化磁珠，海狸公司），进行 SDS-PAGE 检测。1.2.4 摇瓶发酵与高密度发酵 挑取正确的单克隆接种于 50 mL BMGY 生长培养基中，30培养 48 h，制作发酵种子液。摇瓶发酵在含有 200 mL 低盐发酵培养基的锥形三角瓶（1 L）中进行，培养温度 30，摇床转速 200 r/min，每个菌株设置 3 个平行。高密度发酵在含有 7 L 低盐发酵培养基的发酵罐（10 L）中进行，温度 30，溶氧量 30%，菌株生长前期以甘油为碳源，控制 pH 4.5。当细胞湿重达到 180-200 mg/mL 时，碳源换为葡萄糖，将菌株的状态由生长转换为生产。1.2.5 产物含量的检测 采用高效液相色谱法（HPLC）检测发酵液中的赤藓糖醇、葡萄糖、阿拉伯糖醇、核糖醇等化合物的含量。1 mL 发酵液经12 000 r/min 离心 3 min，用 0.22 m 滤器过滤上清，取 200 L 置于内插管中，4保存待测。检测仪器为示差折光检测器，色谱柱型号 Agilent Hi-Plex Ca（7.7 mm300 mm，8 m），流动相为超纯水，流速生物技术通报 Biotechnology Bulletin2023,Vol.39,No.8140为 0.5 mL/min，柱温 80。2 结果2.1 弱化糖酵解途径细胞从外界吸收葡萄糖，经过磷酸化生成葡萄糖-6-磷酸，其中一部分进入戊糖磷酸途径，另一部分进入糖酵解途径进行代谢。为了使更多的葡萄糖-6-磷酸进入戊糖磷酸途径，进而流向赤藓糖醇的前体物质赤藓糖-4-磷酸，试验首先对糖酵解途径进行了弱化。进入糖酵解途径的葡萄糖-6-磷酸被葡萄糖-6-磷酸异构酶异构化生成果糖-6-磷酸，果糖-6-磷酸在磷酸果糖激酶作用下生成果糖-1,6-磷酸，随后，在醛缩酶的作用下生成甘油醛-3-磷酸（图 1）。已知 P.pastoris 中起作用的磷酸果糖激酶有磷酸果糖激酶 I（PFK1,GenBank：PAS_chr2-1_0402）和磷酸果糖激酶 II（PFK2,GenBank：PAS_chr2-1_0047）。图 1 毕赤酵母中赤藓糖醇合成通路的构建Fig.1 Construction of erythritol biosynthetic pathway in P.pastoris据报道，pfk1、pfk2 在 P.pastoris 中均可实现单独敲除，但不能同时敲除，不论敲除顺序如何，均不能得到 pfk1、pfk2 双敲菌株，因此，选择在 pfk2敲除的菌株 P.pastoris C1 中弱化 pfk1。在 P.pastoris中，甘油的利用受到葡萄糖的抑制，而抑制作用主要是由于甘油代谢的第一步基因甘油激酶基因（gut1）的表达受到调控所致。因此，选择利用甘油激酶基因的启动子 Pgut1 替换了 C1 菌株中 pfk1的启动子，以期利用碳代谢抑制（carbon catabolite repression，CCR）的原理调控糖酵解的代谢流，成功获得菌株 P.pastoris C2。对获得的突变株 P.pastoris C2 及对照菌株 C0 进行摇瓶发酵。菌株首先利用发酵培养基中的甘油为唯一碳源生长24 h，之后补加50 g/L葡萄糖继续发酵。由图 2-A 可以看出，2 株菌在前 24 h 生长基本一致，说明以甘油为碳源时，C2 菌株的 Pgut1-pfk1 正常表达。在培养基中补加葡萄糖后，C2 的生长明显慢于对照菌株 C0，发酵 72 h 时，C2 的 OD600仅为 C0 的2/3。由此可见，敲除pfk2并用Pgut1控制pfk1的表达，以葡萄糖为碳源时减弱了 C2 的糖酵解途径，抑制了菌株生长。同时，发酵结果显示，菌株 C2 在摇瓶发酵过程中产生了副产物阿拉伯糖醇和核糖醇 2023,39(8)141赵思佳等：代谢工程改造毕赤酵母生产赤藓糖醇（图 2-B）。2 个副产物均来自戊糖磷酸途径，说明C2 的戊糖磷酸途径的代谢流得到加强。但副产物的产生会影响目标产物的生产，并对目标产物的分离纯化造成困扰，因此，消除和降低副产物也是本研究的重要内容。AB/h/(gL-1)A：菌株 C0 和 C2 的生长曲线；B：阿拉伯糖醇和核糖醇的生产A:Growth curves of C0 and C2 strains;B:productions of arabitol and ribitol图 2 毕赤酵母菌株 C0 和 C2 的表型验证Fig.2 Phenotype verification of P.pastoris C0 and C2 strains2.2 副产物合成关键基因的敲除根据摇瓶发酵结果，已知 C2 菌株发酵过程中的主要副产物为阿拉伯糖醇和核糖醇。通过 KEGG、NCBI 等数据库分析发现，与这两个副产物合成相关的糖醇脱氢酶基因主要有 3 个：0019（GenBank：PAS_chr2-2_0019）、0754（GenBank：PAS_chr4_ 0754）和 0988（GenBank：PAS_chr4_0988）。其中，0754 和 0988 在 P.pastoris 基因组上的位置相近。通过同源重组的方法将 3 个基因依次敲除，得到突变株 P.pastoris C3（0019）和 C4（001909880754）。对 C3 和 C4 突变株进行摇瓶发酵。结果（图 3）显示，敲除 0019 使 C3 的核糖醇产量相比 C2 降低了 58.6%。由于核糖醇和阿拉伯糖醇来自于同一个前体物核酮糖-5-磷酸，因此 C3 的阿拉伯糖醇产量有所升高。进一步敲除 0988 和 0754 后，C4 的阿拉伯糖醇产量相比 C2 降低了 95.6%，而对应的核糖醇产量有所提升。由此可见，0019 主要催化核糖醇的生产，而 0988 和 0754 主要介导阿拉伯糖醇的生产。C3 和 C4 突变株的副产物总产量（阿拉伯糖醇和核糖醇之和）分别为 5.6 和 1.9 g/L，相比 C2 菌株（6.2 g/L）分别降低了 6.7%和 69.4%。2.3 构建赤藓糖醇合成通路赤藓糖醇合成的前体物是来自戊糖磷酸途径的赤藓糖-4-磷酸。在真菌中，赤藓糖-4-磷酸首先去磷酸化生成赤藓糖，然后在赤藓糖还原酶的作用下还原成赤藓糖醇。在细菌中，赤藓糖-4-磷酸则先被赤藓糖醇-4-磷酸脱氢酶还原成赤藓糖醇-4-磷酸，再通过磷酸酶作用生成赤藓糖醇。本研究选择前一条通路，在 P.pastoris 中构建赤藓糖醇合成途径。2.3.1 赤藓糖还原酶基因的筛选与外源基因的表达 选取不同来源的赤藓糖还原酶基因（表 1）23-25。将选取的赤藓糖还原酶基因以及本研究中所涉及的其他外源基因与含有 His 标签的过表达载体连接（图4-A），并转入 P.pastoris 验证其表达情况。结果显示，4-磷酸赤藓糖磷酸化酶基因 yida，赤藓糖还原酶基因 err1、er（NADH）和 er1，糖醇磷酸酶基因 pyp1及磷酸核酮糖差向异构酶基因 rpe1 能在 P.pastoris中表达（图 4-B），因此，选择这些基因在 P.pastoris中构建赤藓糖醇合成通路。2.3.2 构建毕赤酵母赤藓糖醇合成通路 首先在P.pastoris 中敲入赤藓糖还原酶基因，即过表达 Y.lipolytica 来源的依赖于 NADH 的赤藓糖还原酶基因er（NADH），探究在 P.pastoris 自身含有的磷酸酶基因以及敲入的赤藓糖还原酶基因的作用下能否生产赤藓糖醇。经过基因组编辑，在 C4 菌株中整合了 PGAP-er（NADH）表达框获得菌株 C5。高密度发酵结果显示，C5 突变株的发酵液中没有赤藓糖醇的积累（表 2）。?Arabitol?Ribitol0246?Concentration/(gL-1)C2C3C4图 3 毕赤酵母菌株 C2、C3、C4 阿拉伯糖醇和核糖醇的生产Fig.3 Production of arabitol and ribitol by P.pastoris C2,C3 and C4 strains生物技术通报 Biotechnology Bulletin2023,Vol.39,No.8142酸酶不能将赤藓糖-4-磷酸转化成赤藓糖，需要表达外源磷酸酶基因。因此，选择对糖酵解中的甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因（GAPD，GenBank：PAS_chr2-1_0437）进行弱化，使更多的碳代谢流留在戊糖磷酸途径。将C4菌株的GAPD启动子替换成Pgut1启动子，获得菌株 C6。S.cerevisiae 来源的糖醇磷酸酶 PYP1可以催化赤藓糖醇-4-磷酸水解为赤藓糖醇，因此，在菌株 C6 中过表达经密码子优化后的 pyp1，获得菌株 C7。然而，结果显示，突变株 C7 并没有获得生产赤藓糖醇的能力。在过表达 pyp1 的基础上，选择再整合表达来源于 E.coli 的 4-磷酸赤藓糖磷酸化酶基因 yidA，构建了菌株 C8。结果显示，C8 突变株的生物量相比出发菌株有一定的降低（图 5-A），发酵液中生产了约 30 mg/L 的赤藓糖醇（图 5-B）。另外，副产物阿拉伯糖醇和核糖醇也有一定的积累（图 5-C）。表 2 突变株 C5 高密度发酵产物Table 2 Products of high-density fermentation of mutant C5化合物名称 Compound name最高浓度 Maximum concentration/(g L-1)赤藓糖醇 Erythritol0阿拉伯糖醇 Arabitol1.4核糖醇 Ribitol5.62.4 强化戊糖磷酸途径在 Y.lipolytica 中，过表达戊糖磷酸途径关键酶表 1 本研究中涉及的外源基因Table 1 Exogenous genes involved in this study基因 Gene name功能 Function来源 Source蛋白分子量 Protein molecular weight/kDpyp1糖醇磷酸酶基因 Sugar alcohol phosphatase geneS.cerevisiae30.7yidA去磷酸化酶基因 Dphosphorylase geneE.coli MG165532.9err1赤藓糖还原酶基因 Erythrose reductase geneT.reesei39.5er（NADH）赤藓糖还原酶基因 Erythrose reductase geneY.lipolytica 39.4er（NADPH）赤藓糖还原酶基因 Erythrose reductase geneC.magnoliae JH11034.6er1赤藓糖还原酶基因 Erythrose reductase geneM.megachiliensis39.6er3赤藓糖还原酶基因 Erythrose reductase geneM.megachiliensis39.8ER10赤藓糖还原酶基因 Erythrose reductase geneY.lipolytica CLIB12239.1ER25赤藓糖还原酶基因 Erythrose reductase geneY.lipolytica CLIB12238.2JX885赤藓糖还原酶基因 Erythrose reductase geneY.lipolytica31.4rpe1差向异构酶基因 Epimerase geneS.cerevisiae29.2ABA：T-ARS-PGAP 质粒图谱；B：SDS-PAGE 检测外源基因表达A:T-ARS-PGAP plasmid map;B:SDS-PAGE detection of the expression of exogenous genes.1-11:err1,er（NADH）,er（NADPH）,er,er3,pyp1,ER10,ER25,JX885,rpe1,yidA 图 4 外源基因在毕赤酵母中表达Fig.4 Expressions of exogenous genes in P.pastoris猜测可能有两个原因造成了这个现象：（1）前体物赤藓糖-4-磷酸供给不足；（2）P.pastoris 自身的磷2023,39(8)143赵思佳等：代谢工程改造毕赤酵母生产赤藓糖醇转酮酶基因 TKL 可以提高赤藓糖醇的生产26。并且根据 KEGG 数据库分析，P.pastoris GS115 菌株中缺少磷酸核酮糖差向异构酶基因 rpe。因此，选择过表达 S.cerevisiae 来源的 rpe1 以及 P.pastoris 自身的转酮酶基因 TKL1（PAS_chr1-4_0150），使更多的葡萄糖-6-磷酸流向赤藓糖醇的前体物质赤藓糖-4-磷酸，从而达到提高赤藓糖醇产量的目的。在过表达 pyp1 和 yidA 菌株的基础上，又整合了PGAP-rpe1 和 PGAP-TKL1 表达框，构建了菌株 C10。摇瓶发酵结果由图 6 所示，菌株 C0 与 C10 的生长接近，C10 的赤藓糖醇产量达到 1.2 g/L，相比 C8 提高了约 40 倍。C10 的发酵液中并没有检测到阿拉伯糖醇的生产，但核糖醇达到 10.0 g/L，相比 C8 也大幅提升。摇瓶发酵由于不能控制溶氧和 pH，无法真正反映菌株的生产潜力，因此，使用 10 L 发酵罐对C10 菌株进行了高密度发酵。发酵初期以甘油为碳源，待菌体生长至湿重约 180 mg/mL 后流加 70%葡萄糖进行补料发酵，流加葡萄糖 72 h 后发酵结束。HPLC 分析结果（图 7）显示，突变菌株 C10 赤藓糖醇产量为 10.6 g/L，副产物阿拉伯糖醇 7.5 g/L，核 糖醇 8.7 g/L。ABC/h/(mgL-1)/(gL-1)A：生长曲线；B：赤藓糖醇产量；C：阿拉伯糖醇和核糖醇产量A:Growth curve.B:Production of erythritol.C:Production of arabitol and ribitol图 5 毕赤酵母菌株 C0 和 C8 的表型验证Fig.5 Fermentation profiles of P.pastoris C0 and C8 strains/(gL-1)ABCD/h/h/h/h/(gL-1)/(gL-1)A：生长曲线；B：赤藓糖醇产量；C：核糖醇产量；D：阿拉伯糖醇产量A:Growth curve.B:Production of erythritol.C:Production of ribitol.D:Production of arabitol图 6 毕赤酵母菌株 C0 和 C10 的表型验证Fig.6 Phenotype verification of P.pastoris C0 and C10 strains生物技术通报 Biotechnology Bulletin2023,Vol.39,No.8144?Erythritol?Arabitol?Ribitol04812?Concentration/(gL-1)图 7 毕赤酵母菌株 C10 高密度发酵Fig.7 High-cell-density fermentation with strain P.pastoris C102.5 过表达赤藓糖还原酶对赤藓糖醇产量的影响赤藓糖还原酶可催化赤藓糖生成赤藓糖醇，是赤藓糖醇合成途径的最后一步催化酶，其活性对赤藓糖醇的生产尤为关键。根据不同来源的赤藓糖还原酶在 P.pastoris 中的表达情况（图 4-B），选择来源于 Y.lipolytica 的依赖于 NADH 的 er（NADH）和来源于 T.reesei 的依赖于 NADPH 的 err1 进行过表达27-28。2 个基因使用 PGAP 作为启动子整合到了C10 菌株的基因组上，分别得到突变株 C11（PGAP-err1）和 C12（PGAP-er（NADH）。对 C11、C12 菌株进行摇瓶发酵（表 3）。C11 和 C12 的赤藓糖醇产量均为 1.2 g/L，与 C10 的摇瓶发酵产量一致。C10 菌株在摇瓶发酵中没有检测到阿拉伯糖醇，而 C11 和C12 的阿拉伯糖醇产量分别达到 4.9 和 5.1 g/L，说明过表达的 2 个还原酶对核酮糖底物也可能具有一定的还原活性，因此，造成了阿拉伯糖醇产量的提升。表 3 突变株 C11 和 C12 摇瓶发酵产物Table 3 Products of shake-flask fermentation of mutant C11 and C12化合物名称Compound name最高浓度 Maximum concentration/（gL-1）C11C12赤藓糖醇 Erythritol1.21.2核糖醇 Ribitol1.64.0阿拉伯糖醇 Arabitol4.95.1对副产物含量较少的菌株 C11 进行了高密度发酵（图 8）。C11 高密度发酵的湿重最高可达 320.0 mg/mL，赤藓糖醇在发酵过程中一直积累，发酵结束时产量仅为 2.1 g/L，相比 C10 的高密度发酵有较大幅度的降低。副产物阿拉伯糖醇和核糖醇产量达到了 17.9 和 18.5 g/L，相比 C10 的高密度发酵有很大程度的提高，再次说明在 P.pastoris 中过表达赤藓糖还原酶对赤藓糖醇的生产具有负面作用。AB/h/h/(gL-1)/(gL-1)/(mgmL-1)A：湿重和葡萄糖含量；B：赤藓糖醇、核糖醇和阿拉伯糖醇产量A:Wet weight and glucose concentration.B:Production of erythritol,ribitol and arabitol图 8 毕赤酵母菌株 C11 高密度发酵Fig.8 High-cell-density fermentation with strain P.pastoris C113 讨论在过去的几十年里，P.pastoris 已经进行了许多成功的糖基化研究，使这种甲基营养酵母成为最常用的蛋白质，特别是人源蛋白质表达酵母宿主之一29。P.pastoris 已被用于在工业水平上生产各种重组蛋白产品，包括微生物蛋白、酶和生物制药蛋白30。近期，它被报道用于合成高价值的生物活性物质。在 P.pastoris 中融合表达 LevB1、SacB 两个酶，1.5 L 生物反应器水平下，从 160 g 蔗糖可以获得 72.9 g 不含单糖的 Levan 型低聚果糖31。应用糖基磷脂酰肌醇锚定系统，将-葡萄糖苷酶 BGL、内切葡聚糖酶 EG、纤维二糖水解酶 CBH 共同展示在P.pastoris 表面，结合 SPI1 启动子和分泌信号序列2023,39(8)145赵思佳等：代谢工程改造毕赤酵母生产赤藓糖醇进一步增强细胞表面纤维素酶活性，获得能将磷酸溶胀纤维素水解为葡萄糖的 P.pastoris 菌株，在此基础上表达丙酮酸裂解酶 UbiC，进行 96 h 分批发酵，该菌株从磷酸溶胀纤维素产生了 975 mg/L 4-羟基苯甲酸，产量比以葡萄糖为底物高 2 倍以上32。通过联合过表达 ZWF1 和 SOL3 提高 NADPH 供应，过表达腺嘌呤磷酸核糖转移酶增强 AMP 供应，低强度表达 NADH 激酶 POS5，敲除 NADH 依赖性二羟基丙酮磷酸还原酶得到 P.pastoris X33-38 菌株。经过 72 h 摇瓶发酵产生了 3.09 g/L-法尼烯，产量比出发菌株高 41.7%33。近几年研究表明，P.pastoris 是性状优良的高价值生物活性物质生产平台。P.pastoris 的众多优势是选择它作为生产赤藓糖醇的宿主细胞的原因，但在本研究开展的过程中也发现以该菌株作为底盘细胞生