DB53/T914—2019甘蔗线条花叶病毒外壳蛋白基因RT-PCR检测技术规程2019-05-15发布2019-08-15实施ICS65.020B15云南省地方标准云南省市场监督管理局发布DB53/T914—2019I前言本标准按照GB/T1.1－2009《标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写》给出的规则起草。本标准由云南省农业科学院甘蔗研究所提出。本标准由云南省农业标准化技术委员会（YNTC07）归口。本标准起草单位：云南省农业科学院甘蔗研究所。本标准主要起草人：单红丽、李文凤、黄应昆、王晓燕、张荣跃、李婕、仓晓燕、罗志明、尹炯。DB53/T914—20191甘蔗线条花叶病毒外壳蛋白基因RT-PCR检测技术规程1范围本标准规定了甘蔗线条花叶病毒外壳蛋白基因的RT-PCR检测的仪器和用具、试剂、检测方法和结果判定等。本标准适用于甘蔗线条花叶病毒的RT-PCR检测。2术语和定义下列术语和定义适用于本文件。2.1甘蔗线条花叶病毒甘蔗线条花叶病毒(Sugarcanestreakmosaicvirus，SCSMV)属于马铃薯Y病毒科(Potyviridae)禾草病毒属(Poacevirus)，是引起甘蔗花叶病的主要病毒之一，详见附录A。2.2外壳蛋白基因外壳蛋白基因(Coatproteingenes,cpgenes)，是一种合成外壳蛋白的模板，通过转录、翻译合成外壳蛋白，同病毒的遗传物质构成完整病毒的RNA或DNA片段。2.3RT-PCR反转录聚合酶链式反应(ReverseTranscription-PolymeraseChainReaction)的简称，是一种在体外利用反转录酶将RNA反转录为cDNA，再以cDNA为模板进行PCR反应，以实现扩增RNA上特异片段。3仪器和用具3.1主要仪器电子天平，高速冷冻离心机，蛋白/核酸分析仪，PCR扩增仪，涡旋混匀器，微波炉，电泳仪，水平电泳槽，凝胶成像仪，冰箱。3.2用具及耗材DB53/T914—20192可调微量移液器，研钵，移液器吸头，离心管，PCR管。4试剂4.1常规试剂液氮，焦碳酸二乙酯（DEPC）水，RNA提取试剂，三氯甲烷，异丙醇，70%乙醇，无水乙醇。4.2RT-PCR试剂Oligo(dT)18引物（0.5µg/µL），反转录酶（200U/µL），RNA酶抑制剂(40U/µL)，dNTP混合物（10mmol/L），含染料的TaqDNA聚合酶混合物（5U/µL）。4.3引物引物应符合以下要求：a)引物序列,上游引物SCSMV-F：5′-ACAAGGAACGCAGCCACCT-3′,下游引物SCSMV-R：5′-ACTAAGCGGTCAGGCAAC-3′；b)目的扩增片段长度约940bp；c)用灭菌DEPC水将上、下游引物分别配制成浓度为20μg/μL的水溶液。4.4电泳缓冲液按以下配制电泳缓冲液：a)50×TAE储存液：取242gTris，先用300mLddH2O搅拌溶解后，加100mL0.5mol/LEDTA的水；b)用...
