SNT 3731.4-2013 食品及饲料中常见禽类品种的鉴定方法 第4部分：火鸡成分检测 实时荧光PCR法.pdf

SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T3731.4-2013食品及饲料中常见禽类品种的鉴定方法第4部分：火鸡成分检测实时荧光PCR法Identification of poultry ingredient in food and feed-Part 4:Detection of turkey ingredient-Real-time PCR method2013-11-06发布2014-06-01实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布SN/T3731.4-2013OD:光密度值(optical density)5方法提要样品经研磨后，提取DNA,以DNA为模板，采用火鸡的12 S rRNA基因特异性检测引物和探针进行实时荧光PCR扩增，观察实时荧光PCR的增幅现象，判断样品中是否存在火鸡成分。6试剂和材料除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂。实验用水符合GB/T6682的要求。所有试剂均用无DNA酶污染的容器分装。6.1检测用引物和探针检测用引物和探针见表1。表1名称序列(5-3)目的基因火鸡成分5端引物TGTAGCCCTAGCCGTGCGGCTAACC火鸡成分3端引物TAGGATGATAAACGTAATAAGGGCTG火鸡12 S rRNA基因火鸡成分探针FAM-CGCCGGACACCTCCTAATACACCTC-MGB6.2试剂6.2.1CTAB提取缓冲液：20g/L CTAB,1.4mol/L NaCl,0.1mol/L Tris-HCl,0.02mol/LNa2 EDTA,pH8.0。6.2.2CTAB沉淀液：5g/L CTAB,40mmol/L NaCl。6.2.3蛋白酶K溶液(20mg/mL)。6.2.4NaC1溶液(1.2mol/L)。6.2.5三氯甲烷（氯仿）。6.2.6异丙醇。6.2.770%乙醇。6.2.8TE缓冲液(Tis-C、EDTA缓冲液)：l0mmol/LTis-HCl(pH8.0),1mmol/L EDTA(pH8.0).6.2.9实时荧光PCR反应混合液：12.5L反应体系包括：1U2U的Tag酶、1PCR缓冲液、2.5mmol/L4.0mmol/L的Mg2+、0.2U1U的UNG酶、0.2mmol/L的d(A,C,G)TPs、0.2mmol/L0.4mmol/L dUTP、400nmol/LROX染料（某些荧光PCR仪不需要ROX校正）。如果具有等效的商品化试剂盒，则可使用这些等效产品。7仪器设备7.1实时荧光PCR仪7.2核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。7.3恒温水浴锅。7.4离心机：最大离心力不小于12000g。2