DB15T 2788-2022 向日葵根尖染色体制片和核型分析技术规程.pdf

ICS 65.020.01 CCS B 01 15 内蒙古自治区地方标准 DB15/T 27882022 向日葵根尖染色体制片和 核型分析技术规程 Technical code of practice for chromosome preparation and karyotype analysis of root tip of sunlower 2022-08-30 发布 2022-09-30 实施 内蒙古自治区市场监督管理局 发 布 DB15/T 27882022 I 前言 本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。本文件由内蒙古自治区农牧厅提出。本文件由内蒙古自治区农业标准化技术委员会（SAM/TC 20）归口。本文件起草单位：内蒙古自治区农牧业科学院。本文件主要起草人：孙瑞芬、李素萍、于海峰、郭树春、张立华、孙峰成、乔慧蕾、聂惠、邵盈、牟英男、韩平安、聂利珍、牛素清、常悦、唐宽刚、梁晨、吴家瑗。DB15/T 27882022 1 向日葵根尖染色体制片和核型分析技术规程 1 范围 本文件规定了向日葵根尖染色体玻片标本制备的仪器和设备、试剂配制、制备方法及核型分析方法。本文件适用于向日葵根尖染色体玻片标本制备和核型分析。2 规范性引用文件 本文件没有规范性引用文件。3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。染色体 chromosome 细胞内具有遗传性质的遗传物质深度压缩形成的聚合体，一般呈棒状，因易被碱性染料染色，故称染色体。随体 satellite 通过次缢痕与染色体主要部分相连，位于染色体末端的、圆形或椭圆形的染色体片段，称为随体。具随体的染色体称为随体染色体，用sat表示。核型 karyotype 染色体组在有丝分裂中期的表型，包括染色体数目、大小、形态等特征。核型分析 karyotype analysis 利用染色体制片对体细胞分裂中期的染色体直接进行观察、计数、分组，并对每个染色体形态特征进行定量和定性的描述，即为核型分析。4 仪器和设备 电子分析天平：精度 0.001 g。冰箱。DB15/T 27882022 2 恒温培养箱。光学显微镜(配有 100 倍油镜、成像系统)。5 试剂配制 0.002 mol/L 8-羟基喹啉 称取0.0145 g 8-羟基喹啉于蒸馏水中，60 水浴溶解后定溶至500 mL。卡诺氏(Carnoys)固定液 无水乙醇：冰醋酸=3:1(体积比)，现用现配。1 mol/L 盐酸 取比重1.19的盐酸82.5 mL，用蒸馏水定溶至1000 mL。改良卡宝品红染液 A液：称取3 g碱性品红，溶于100 mL 70%的乙醇，可以长期保存。B液：取10 mL A液加入90 mL 5%苯酚水溶液，在37 条件下温育2 h4 h(限14 d内使用)。卡宝品红染液：取B液45 mL，加入6 mL 37%的甲醛，6 mL冰乙酸，充分混匀(可长期保存)。改良卡宝品红染液：取10 mL卡宝品红染液，加入45%的冰乙酸90 mL和1.8 g山梨醇，室温下 放置14 d后使用。酶液 2%纤维素酶溶液：称取2 g纤维素酶，加蒸馏水，定容至100 mL。0.5%果胶酶溶液：称取0.5 g果胶酶，加蒸馏水，定容至100 mL。酶液：2%纤维素酶溶液和0.5%果胶酶溶液等量混合后，过滤除菌。苏木精染液 甲液：称取1 g苏木精溶于6 mL无水乙醇中，即成苏木精-乙醇溶液。乙液：称取10 g铵矾溶于90 mL蒸馏水中，即成10%铵矾水溶液。苏木精染液：取甲液逐滴加入到乙液中，用纸遮盖，放在阳光明亮处，使其充分氧化，3 d4 d后将溶液过滤，在滤液中加入25 mL甘油和25 mL甲醇，保存在密闭玻璃瓶内，静置30 d60 d，待液体颜色变深时过滤，可长久保存。6 染色体标本制备 常规压片法 6.1.1 材料种植 挑选向日葵籽粒饱满、大小一致的种子，于温水中浸泡1 h2 h后，均匀摆放在铺有3层浸润滤纸的培养皿中，25 培养箱中萌发。6.1.2 根尖切取与预处理 DB15/T 27882022 3 当幼根长到1.5 cm左右时，于上午9:3010:00切取根尖，用0.002 mol/L 8-羟基喹啉处理5 h。6.1.3 固定 将预处理后的根尖转入卡诺氏固定液中，常温条件下固定24 h后转入70%乙醇中，4 保存备用，不超过60 d。6.1.4 解离 从70%乙醇中取出根尖，ddH2O冲洗23次后，用无菌滤纸吸干水分，转入离心管中，加入1 mol/L HCl，60 水浴5 min。6.1.5 染色与压片 将解离后的根尖移至载玻片上，切取根尖分生组织部分并吸干水分，滴一滴改良卡宝品红染液，盖上盖玻片，吸去多余染液，用竹签轻轻垂直敲打，并用拇指均力压片，使材料分散压平。6.1.6 封片 在染色体分散较好的载玻片上滴一滴中性树胶封片，贴上标签注明，制成永久制片。去壁低渗法 6.2.1 材料种植 同6.1.1。6.2.2 根尖切取与预处理 同6.1.2。6.2.3 固定 同6.1.3。6.2.4 前低渗 从70%乙醇中取出根尖，ddH2O冲洗23次后，用无菌滤纸吸干水分，切下根尖前端乳白色部分(分生区)，去掉根冠，转移到ddH2O中，常温下前低渗30 min。6.2.5 酶解 取出前低渗后的材料，用无菌滤纸吸干水分，移入酶液中(实验材料与酶液的体积比控制在1:201:50)，37 水浴酶解50 min。6.2.6 后低渗 小心洗去酶液，转入ddH2O中，常温下后低渗5 min10 min。6.2.7 再固定 将后低渗的材料用卡诺氏固定液固定10 min15 min。6.2.8 制片 DB15/T 27882022 4 6.2.8.1 压片法 将后低渗的根尖12个移至载玻片上，吸干水分，滴一滴苏木精染色，盖上盖玻片，吸去多余染液，用竹签轻轻垂直敲打，用拇指均力压片，使材料分散压平。6.2.8.2 涂片法 涂片法包括以下3步：a)涂片：将后低渗的根尖 12 个移至载玻片上，用镊子将其夹碎并均匀涂抹于载玻片的涂面上，夹去大块残渣，加一滴固定液使细胞充分展开；b)火焰干燥：将玻片在酒精灯上快速微微加热烤干；c)染色：滴一滴苏木精染色，室温下晾干。6.2.9 封片 同6.1.6。镜检和拍照 用光学显微镜观察制片。先在40倍物镜下找到清晰的细胞，再转换至100倍物镜，滴上松柏油进行观察，找到染色较深、分散好且较清晰的染色体中期相细胞进行计数、拍照记录。7 染色体核型分析 染色体数确定 以体细胞染色体数目为准。统计30个以上染色体分散良好的细胞观察计数，且85%以上的细胞具恒定一致的染色体数，即为该细胞的染色体数目。染色体形态确定 以体细胞分裂中期的染色体作为基本形态。统计5个以上分裂中期的、具有高质量的染色体图像作为形态描述。染色体序号 染色体序号一律按染色体全长由大到小顺序编号，并用阿拉伯字母表示。如两对染色体长度完全相等，则按短臂长度顺序排列，长者在前、短者排后。核型分析参数 7.4.1 染色体长度测量及计算 利用Adobe Photoshop图片处理软件进行染色体的剪贴、排列和同源染色体的配对，测量染色体长度，具体步骤见附录A。利用Excel工作表计算染色体核型参数，具体步骤见附录A。其中，染色体总长度为单倍体组染色体长度之和，单位用微米(m)表示；相对长度为每条染色体长度与染色体总长度之比，再乘以100%，用百分比()表示；相对长度系数为每条染色体长度/单倍体组染色体平均长度；染色体长度比为最长染色体长度与最短染色体长度之比。7.4.2 臂比 DB15/T 27882022 5 臂比长臂长度/短臂长度。7.4.3 着丝点位置确定 以臂比值确定，取小数点后两位数值，按照附录B中的表B.1。7.4.4 染色体长度类型确定 依据染色体相对系数值确定，按照附录B中的表B.2。核型分类 根据染色体的长度比和臂比主要特征区分核型的对称和不对称程度，分为12种类型，按照附录B中的表B.3。核型表述 核型分析中各项测定的平均数值,保留小数点后2位数。随体的长度不作统一规定，但应在表下加以文字注明，其格式和内容如按照附录B中的表B.4。染色体核型图绘制 根据每条染色体的相对长度、相对长度系数、臂比等参数进行同源染色体“配对”，参数最接近的为同源染色体，然后按染色体序号顺序排列，即为该细胞的染色体核型图。具体步骤见附录C。染色体核型模式图绘制 以各染色体的相对长度为纵坐标，染色体序号为横坐标绘制，其中纵坐标零点对应的位置为着丝点位置，纵坐标零点以上的部分为短臂的模式图，纵坐标零点以下的部分为长臂的模式图。具体步骤见附录C。核型公式 将核型的主要特征，如染色体数目、臂比、着丝点位置、随体等以公式表示。示例：向日葵(Helianthus annuus L.)某品种的核型公式为2n=2x=34=30m+4sm(2sat)。DB15/T 27882022 6 A A 附录A （资料性）染色体长度测量步骤 A.1 染色体长度测量步骤 A.1.1 扫描修整图像 取5张形态清晰、分散好的染色体标本片图像，打开Photoshop7.0，从文件下拉菜单中打开染色体图像，用裁剪工具将不需要的部分裁去，调正图像位置，调整好亮度、对比度，然后修整图像，用橡皮擦擦除染色体以外的部分，另存图像。A.1.2 目测整理同源染色体并测量 第一步：先通过目测将特征明显、容易分辨的同源染色体进行整理、配对。用套索工具从照片中圈选同源染色体，从编辑菜单中选择自由变换，此时被圈选的染色体外出现一个矩形框，用鼠标按住矩形框的一个角可自由地旋转被选中的染色体，使短臂朝上，长臂朝下。调整好染色体的方向后，按回车键又可返回到套索工具中，移动工具可以将染色体拖向任何位置。重复上述过程，可以将所有同源染色体配对。在配对过程中，可借助放大工具，看清染色体的细节。第二步：测量各条染色体的臂长，根据这些结果，再将第一步中“误配”的染色体进行调整。测量时，在菜单中选编辑预设参考线和网格，将其中的网格线间距设为1 cm，在视图菜单中选标尺，视图显示网格，将图像放大到300%左右，根据网格线标示准确测量每条染色体长度(长臂、短臂长度，随体不计算在内)并做记录。A.2 染色体参数计算 将染色体参数的相对长度数据输入到Excel工作表中，注意输入数据时短臂的数据为正，长臂的数据为负，随体位于短臂一方，计算出每条染色体的绝对长度、相对长度、相对长度系数、臂比，计算公式见7.4.1。DB15/T 27882022 7 B B 附录B （规范性）着丝点位置 B.1 着丝点位置见表 B.1。表B.1 着丝点位置 臂比 着丝点位置 符号 1.00 正中着丝点 M 1.01-1.70 中着丝点 m 1.71-3.00 近中着丝点 sm 3.01-7.00 近端着丝点 st 7.01 以上 端着丝点 t B.2 染色体长度类型见表 B.2。表B.2 染色体长度类型 相对长度系数值 长度类型 符号 0.75 短染色体 S 0.76-1.00 中短染色体 Ml 1.01-1.25 中长染色体 M2 1.26 长染色体 L B.3 染色体核型分类标准见表 B.3。表B.3 染色体核型分类标准 染色体长度比(L/S)臂比21 的染色体的百分比 0.0 0.01-0.5 0.51-0.99 1.00 21 1A 2A 3A 4A 21-41 1B 2B 3B 4B 41 1C 2C 3C 4C B.4 染色体核型分析参数见表 B.4。表B.4 染色体核型分析参数 序号 染色体长度(m)相对长度(%)相对长度系数 臂比 染色体类型 着丝点类型 长臂 短臂 全长 1 2 .注：具随体(或次缢痕)的染色体(sat)用“*”标记 DB15/T 27882022 8 C C 附录C （资料性）染色体核型图绘制 C.1 染色体核型图绘制 根据最后计算结果调整第一步中的误配，参数最接近的为同源染色体，将配对的同源染色体按大小顺序依次分组排列成核型图。如果有染色体是重叠的，可以选几张照片，