SN中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SNfT1377-2004从精液中分离马病毒性动脉炎病毒试验操作规程Protocoloftheisolationofequineviralarteritisvirusfromstallionssemen2004-06-01发布2004-12-01实施中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布SN/T1377-2004前言本标准的附录A是规范性附录。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位:中华人民共和国山东出人境检验检疫局.本标准主要起草人:梁成珠、朱来华、王树锋、王丽。本标准系首次发布的出人境检验检疫行业标准。SN/T1377-2004从精液中分离马病毒性动脉炎病毒试验操作规程范围本标准规定了从精液中分离马病毒性动脉炎病毒试验方法。本标准适用于从精液中分离马病毒性动脉炎病毒。2缩略语下列缩略语适用于本标准。1EAV:马病毒性动脉炎病毒。ZMEM:含非必需氨基酸的细胞培养液。仪器设备么233.1超净工作台或生物安全柜。3.2二氧化碳培养箱。3.3倒置显微镜。3.4液氮贮存罐。3.5蔡氏滤器和微孔滤膜(0.22jam),3.6蒸汽消毒器。3.7微量细胞培养板(96孔)。3.8微型振荡器。3.9可调微量移液器和吸嘴(200KL),3.10电子天平(0.1mg-200g),3.11吸管(1mL,2mL,5mL,10mL),试剂4.1抗生素贮存液。4.27.5%碳酸氢钠溶液。4.3细胞消化液(0.02%EDTA)。4.4标准病毒株和细胞系:一196'C(液氮)冻存备用。4.4.1标准病毒株:马病毒性动脉炎病毒(EquineArteritisVirus,EAV)Bucyrus株。4.4.2细胞系:兔肾细胞(RK-13),4.5细胞培养液和细胞维持液。4.61%细胞染色液。4.77.5%梭甲基纤维素。5操作方法精液采集准备干净、无菌的采精管(如假阴道、阴茎套)。采精管不得含有防腐剂或消毒剂。SN/T1377-20045.1.2采集精液时可同时采两份，也可在不同时间各采一份，应采集含精子量多的部分(射精中期)作为待检样品进行病毒分离。5.1.3采精后，应立即将含精液的采精管放人碎冰中或冰盒中，尽快送到实验室。如果不能及时送实验室，可将精液暂时冷冻于一20℃以下保存(不超过7d)，冷冻精液不影响病毒的分离。5.2病毒分离5.2.1将精液进行预处理，超声波裂解三次，每次15S.5.2.2在4℃下1000g离心10min，沉淀精子细胞。5.2.3上清液用维持液做10-1-10-3系列稀释，接种于已长成单层的RK-13细胞瓶或细胞培养板上，每个滴度接种两瓶或两孔。同时设立细胞对照和阳性对照，单层细胞仅加维持液做细胞对照，用60倍稀释的标准病毒接种做阳性对照。5.2.4加盖摇匀使之均匀分布于整个细胞层。5.2.5在5%二氧化碳恒温恒湿二氧化碳培养箱中...
