ICS65.020.99B22备案号：40447-2014江苏省地方标准DB32DB32/T2561-2013鹅坦布苏病毒的检测RT-PCR方法MethodofRT-PCRdetectingGooseTembusuVirus2013-12-20发布2014-01-20实施江苏省质量技术监督局发布DB32/T2561-2013前言为规范鹅坦布苏病毒分子生物学检测技术，提高鹅坦布苏病毒检测的灵敏度、稳定性、特异性，特制定本标准。本标准按GB/T1.1-2009《标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写》编写。本标准的附录A为规范性附录。本标准的附录B为规范性附录。本标准由江苏省农业科学院提出。本标准起草单位：江苏省农业科学院。本标准起草人：黄欣梅、李银、刘宇卓、赵冬敏、韩凯凯。DB32/T2561-20131鹅坦布苏病毒的检测RT-PCR方法1范围本标准规范了鹅坦布苏病毒分子生物学检测技术RT-PCR的所用引物序列、所涉及的样品范围、操作流程、反应条件等技术标准。本标准适用于检测鹅脾脏和病毒细胞培养液中鹅坦布苏病毒核酸。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修订单）适用于本文件。GB16548—2006病害动物和病害动物产品生物安全处理规程NY/T541—2002动物疫病实验室检验采样方法3方法原理聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction），简称PCR，是一种分子生物学技术，用于放大特定的DNA片段，可看作生物体外的特殊DNA复制。PCR技术以其快速、敏感和特异等优点在动物疫病检测中得到广泛应用，而且随着PCR技术的不断改进，这种针对病原核酸的诊断方法表现出更准确、灵敏和特异的特点。本标准选取了鹅坦布苏病毒非结构蛋白NS5基因保守区域，设计了一对特异性引物，经过了PCR条件的优化、特异性试验、敏感性试验等，对鹅坦布苏病毒的鉴定具有很高的准确性。4仪器设备和主要试剂4.1仪器设备PCR仪，离心机，电泳槽，微量移液器，凝胶成像系统。4.2主要试剂TRIZOL，氯仿，异丙醇，无水乙醇，焦炭酸二乙酯（DEPC）处理的灭菌双蒸水，AMV反转录酶，5×AMVBuffer，10mmol/LdNTPs，随机引物，RNA酶抑制剂，25mmol/LMgCl2，10×EXTaqDNA聚合酶Buffer，EXTaqDNA聚合酶，2.5mmol/LdNTP，DNAMarkerDL-2000，琼脂糖。5引物上游引物：5′-GCGGCTCAAGTGGGA-3′；下游引物：5′-CCTCGGTTGTTTGTTTCT-3′。6样品采集按照NY/T541-2002动物疫病实验室检验采样方法，病死或扑杀发病鹅，无菌采集脾脏、肝脏、脑、肺脏、肾脏等组织置于－20℃保存，最好用...
