ICS65.020.30B41备案号：江苏省地方标准DBDBDBDB32323232DB32/T1775—2011Ｉ型鸭肝炎病毒的检测RT-PCR方法MethodofRT-PCRdetectingDuckVirusHepatitisI2011-05-06发布2011-07-06实施江苏省质量技术监督局发布DB32/T1775—2011I前言为规范Ｉ型鸭肝炎病毒分子生物学检测技术，提高鸭肝炎病毒检测的灵敏度、稳定性、特异性，特制定本标准。本标准按GB/T1.1-2009《标准化工作导则第1部分：标准结构和编写》编制。本标准的附录A为规范性附录。本标准由江苏省农业科学院提出。本标准起草单位：江苏省农业科学院。本标准起草人：魏雪涛、李银、刘宇卓、张敬峰。DB32/T1775—20111Ｉ型鸭肝炎病毒的检测RT-PCR方法1范围本标准规范了Ｉ型鸭肝炎病毒分子生物学检测技术RT-PCR的所用引物大小、所涉及的样品范围、操作流程、反应条件等技术标准。本标准适用于检测鸭肝脏和病毒尿囊液中I型鸭肝炎病毒核酸。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的，凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682-2008分析实验室用水规格和试验方法NY/T541-2002动物疫病实验室检验采样3方法原理聚合酶链式反应(PolymeraseChainReaction)，简称PCR，是一种分子生物学技术，用于放大特定的DNA片段，可看作生物体外的特殊DNA复制。PCR技术却以其快速、敏感和特异等优点在动物疫病检测中得到广泛应用，而且随着PCR技术的不断改进，这种针对病原核酸的诊断方法表现出更准确、灵敏和特异的特点。本标准选取了DHVIVP1基因的保守，设计了一对特异性引物，经过了PCR条件的优化、特异性实验、敏感性试验等，对DHVI的鉴定具有很高的准确性。4仪器设备和主要试剂4.1仪器设备：PCR仪，离心机，电泳槽，微量移液器，凝胶成像系统4.2主要试剂：TRIZOL，氯仿，异丙醇，无水乙醇，焦碳酸二乙酯(DEPC)处理的灭菌双蒸水，AMV反转录酶，5×AMVBuffer，10mmol/LdNTPs，RNA酶抑制剂，25mmol/LMgCl2，EXTaqDNA聚合酶，10×EXTaqDNA聚合酶buffer，2.5mmol/LdNTP，DNAMarkerDL-2000，琼脂糖。5引物上游引物：5′-ATCTAATGTCCCGATACAAGGTG-3′；下游引物：5′-ACGCTAGTGTTTTGAGTCTAAGGC-3′。6样品采集按照NY/T541-2002动物疫病实验室检验采样方法，病死或扑杀鸭，无菌采集肝脏组织。7方法步骤DB32/T1775—20112试验用水：按照GB-T6682-2008三级水标准7.1样品处理取病料0.5g～1g置研钵中剪碎并研磨，反复冻...
