1组织病理学制片技术.pptx

Notice 1.上课请关手机（或调成振动，接电话到室外）。2.选修课自愿选择，试听一次，下次课班长提交选修课学生名单(包括email)。3.学分问题 平时表现 如：纪律、问答、作业。结课测验?对本课程的意见和建议；生命科学研究中心 邢立强 目的和要求目的和要求 Aims and Requirements 了解生物组织的特点及取材的注意事项；熟悉切片的原理、一般要求及注意事项；掌握石蜡切片制作技术；病理学常用的观察手段病理学常用的观察手段 The common survey means in pathology 1、大体标本观察：主要用肉眼、量尺及各种衡器等辅助工具，对所检标本的大小、形状、色泽、重量、表面及切面、病灶特点进行观察及测量。2、组织切片的观察：取正常或病变组织进行切片、染色(HE染色最常用)在显微镜下进行观察。病理学标本的种类病理学标本的种类 Types of pathologic samples 1、活体组织检查(Biopsy)：简称活检，从患者活体局部切取、钳咬、细针吸取和摘取等手术方法获取病变组织进行病理检查。2、脱落细胞学检查(Exfoliative cytological exam)：对患者痰液、胸腹水、尿液以及阴道刮片、食管拉网、纤维胃/支气管镜所取得的材料进行涂片，以检查脱落细胞，是早期发现和诊断肿瘤的好方法。3、尸体解剖(Autopsy)：通过尸检可查出病因和病变，及时发现和确诊某些传染病、新发现的疾病，积累经验，提高诊疗水平。4、动物实验(Animal experiment)：根据研究需要，在动物身上复制人类某些疾病的模型、进行观察研究，了解疾病的病因、发病机制及药物疗效等。5、组织/细胞培养(Tissue and Cell culture)：将某种组织或单细胞在适宜的培养基中体外培养，来研究各种病因作用下组织、细胞的病理变化及治疗效果。病理技术的应用病理技术的应用 Application of pathologic technique 帮助临床查明死因(尸检);手术后病变标本，明确诊断(临床活检);为教学、科研提供资料;取材(Sample collection)固定(Fixation)脱水(Dehydration)透明(Transparentizing)浸蜡(Paraffin soaking)包埋(Embedding)第一节第一节 组织处理组织处理 Tissue processing 1.人为因素 2.标本大小 3.取材时间 4.包埋方向 5.边缘标记 一、取材一、取材(Samples collection)6.小标本的处理方法 7.特殊情况取材 8.取材数量 9.清除多余成分 10.重复取材 11.核对取材 12.剩余组织存放 二、固定二、固定(Fixation)固定就是用物理或化学方法，阻止组织细胞离体或培养细胞脱离生存环境后发生形态学变化。(一一)固定的目的固定的目的 1.迅速阻断组织细胞离体后的自溶性变化，防止腐败，尽量保持组织细胞生活状态下的形态结构。2.使细胞内的蛋白质、脂肪、糖、酶等成分转变成不溶性物质，并保持原有的空间位置。3.固定剂有硬化作用,增加组织的硬度,便于制片。4.组织中的各种物质经固定后产生对染料的亲和力，利于染色和观察。（二）常用的固定方法（二）常用的固定方法 1.浸泡固定法 2.灌注固定法 3.细胞涂片的固定方法 4.微波固定法 5.蒸气固定法（三）常用的固定液（三）常用的固定液 1.单纯固定液(1)甲醛(formaldehyde)(2)酒精(alcohol)(3)苦味酸(picric acid)(4)丙酮(acetone)(5)醋酸(acetic acid)2.混合固定液(1)Bouin液：用于结缔组织及脂肪染色；(2)Zenker液：常用于三色染色；(3)4%多聚甲醛-磷酸二氢钠-氢氧化钠液；（四）固定后的处理（四）固定后的处理 1.一般固定液(甲醛等)固定组织后，用流水冲洗以清除组 织内的固定液终止固定。2.含有乙醇、乙酸及苦味酸的固定液，组织固定后不需要或不能用水冲洗。3.含有铬酸、重铬酸钾和锇酸的固定液，组织固定后应充分水洗，一般为1224h。4.用含汞的固定液固定组织后，要进行脱汞处理，可在组织脱水前或切片染色前进行，一般多在染色前脱汞。其方法为切片脱蜡入水后，入0.5%碘乙醇510min，水洗后再入3%5%硫代硫酸钠或95%乙醇12min，再充分水洗，蒸馏水洗后进行染色。（五）固定时的注意事项（五）固定时的注意事项 1.标本 应新鲜并及时取材，快速放入固定液中。特殊标本应单独固定和存放。2.固定液的用量 一般固定液用量为组织块体积的1020倍，贵重的固定液不少于35倍。避免组织紧贴容器底部，影响固定效果。对于特殊染色的组织(如神经染色及酶组织化学染色等)固定时应考虑组织块的大小、固定液种类、固定时间和温度等。酶组织化学染色组织的固定应置于冰箱4固定。3.防止组织变形 柔软或较薄的组织先平铺在吸水纸上，再投入固定剂中；含气或脂肪多的组织易浮于液面，可在组织表面覆盖棉花以达到充分固定。4.固定液的穿透性 一般固定液在24h内不能穿透厚度大于23mm的实体组织或5mm的多孔疏松组织，故取材组织块的厚度原则上不应超过34mm。5.固定时间 固定的时间与固定液的种类、组织类型、块大小、温度等有关。一般1.5cm 1.5cm 0.2 0.3cm大小的组织块,固定时间为1224h。6.固定温度 大多数可在室温(25)固定，在低温(如4)固定时，固定时间要相应延长。三、三、脱水脱水(Dehydration)组织经固定和水洗后含大量水分，水与石蜡不能混溶。因此在浸蜡和包埋前，必须进行脱水。常见的脱水剂有乙醇、正丁醇、丙酮等。为防止水份丢失过快，造成组织变形，一般采用梯度脱水法。也就是使脱水剂的浓度逐渐升高，脱水过程尽量缓和，减少组织变形。四、透明四、透明(Transparentizing)常用的透明剂有二甲苯、苯、甲苯、氯仿、环己酮、苯甲酸甲酯、香柏油、冬青油和苯胺油等。目前也有用环己酮作为透明剂，环己酮为无色无毒液体，可与苯、二甲苯和酒精等相混合，也可溶解石蜡。而且脱水时组织不收缩变硬，用于快速石蜡切片效果较好。五、浸蜡五、浸蜡(Paraffin wax soaking)用熔化的切片石蜡逐渐替换组织中二甲苯的过程。六、组织的包埋和包埋方法(Embedding)（一）常规石蜡包埋 （二）脱落细胞标本的包埋 （三）微小标本的包埋 第二节第二节 组织切片法组织切片法 (Tissue sectioning)组织切片法包括石蜡切片法、冰冻切片法、火棉胶切片法、树脂包埋薄切片法和大组织石蜡切片法等。常用的切片工具包括组织切片机、切片刀和自动磨刀机等。一、组织切片机和切片刀 1.石蜡切片机石蜡切片机 2.火棉胶切片机火棉胶切片机 3.恒冷箱切片机恒冷箱切片机 4.震动切片机震动切片机 石蜡切片机石蜡切片机 震动切片机震动切片机 恒冷箱切片机恒冷箱切片机 切片刀切片刀 切片刀是切片机的重要部件，常见的有两种：一种为可重复使用的钢刀，一般有4cm、8cm、14cm、18cm、2024cm等，根据切片刀的形态，有平凹型、深平凹型、平楔型、双凹型。另一种为一次性钢刀片，是一种薄型切片刀片，用于普通石蜡切片。使用时固定在特制的刀架上。各种切片刀的剖面图 a平凹形 b深平凹形 c平楔形 d双凹形 石蜡切片机用一次性钢刀片 二、组织切片二、组织切片(Tissue sectioning)石蜡切片仍是目前各种切片制作方法中最常用、最普遍的一种方法。(一一)切片前的准备切片前的准备 1.备齐常用器具,如玻片、毛笔和铅笔或刻字笔。2.检查切片机的工作状态,将固件都拧紧，检查切片刀是否锋利,切片刀质量是保证切片的关键。如果使用一次性刀片,应根据切片情况及时调整刀刃位置。3.清洁玻片的方法（1）新载玻片的处理：先用清洁液浸泡1224h,流水充分冲洗后,用蒸馏水洗35遍,95%酒精浸泡2h,用绸布擦干或用烘箱烤干备用。清洁液是用重铬酸钾和浓硫酸按比例配成的洗液。常用的有以下几种配方：重铬酸钾(g):浓硫酸(ml):蒸馏水(ml)=1:1:10;重铬酸钾:浓硫酸:蒸馏水=2:3:25;重铬酸钾:浓硫酸:蒸馏水=2:5:15。（2）盖玻片的处理：盖玻片可按以上方法处理，但因盖玻片很薄，以上处理程序应缩短。清洁液浸泡2h，流水冲洗。也可用以下方法清洗:盖玻片立排于卧式染缸(排2行，中间隔以载玻片)。松紧度以玻片可轻松转动为好，以下步骤应保持液体进入每个玻片间隙，玻片之间不能有气泡。用1%盐酸酒精浸泡2h，然后流水冲洗干净，再用蒸馏水冲洗数次。入95%酒精浸泡23h，无水酒精浸泡20min，倒掉酒精放60烘箱烤干备用。（二）切片制作过程（二）切片制作过程 1.蜡块在冰箱中预冷，然后固定在切片机上。将切片刀装在刀架上。调整蜡块与刀的位置，使蜡块切面与刀刃接近。2.切片机多为轮转式，使用时左手执毛笔，右手旋转切片机转轮。先修出标本，直到组织全部暴露于切面为止，标本过小时修块应多加注意，大标本要切全。切出蜡带后，用毛笔轻轻挑起一端，用镊子夹起另一端，正面向上放入展片水槽中(水温一般低于蜡熔点1012)，待切片展平后，即可进行捞片。3.切片时刀是由下向上运动，为得到完整的切片，防止组织出现刀纹裂缝，应将组织硬脆难切的部分放在上端(如皮肤组织的表皮部分，胃肠等组织的浆膜面等)。4.捞片时注意组织片的摆放位置，尽量整齐美观。要留出贴标签的空间，5.捞片时注意在切片和玻片之间不要留有气泡。捞好的切片应在60左右烤箱内烤至少30min。以防染色时脱片。（三）石蜡切片制作时的注意事项（三）石蜡切片制作时的注意事项(Attentions)1.组织的取材和固定；2.组织脱水、透明和浸蜡；3.切片组织块固定不牢时；4.切片刀和切片机；5.特殊要求切片的制作。第三节 冰冻切片法(Frozen sectioning)冰冻切片可用于新鲜组织、甲醛固定的组织和低温冰箱冷藏的组织块等。已固定的组织块经流水冲洗后再进行切片。一、冰冻切片法 （一）恒冷箱切片机 提前开机预冷，一般工作温度设定在-22左右。待刀台、样品台和箱内达到设置温度后即可切片。顺序如下：将组织用OCT粘在样品托后放置在速冻台上；组织冻结后，将样品托固定到样品台上；调整组织切面与刀刃位置，初步修出组织切面后，放下防卷板，关闭观察窗，开始切片。切出的切片粘贴到载玻片上，直接冻存或吹干固定。（二）半导体制冷切片机 二、冰冻组织的取材及保存方法二、冰冻组织的取材及保存方法 （一）取材 负责诊断的医师应亲自检查大体标本，做多切面详细检查，必要时可在解剖镜下观察。选取最具代表性的组织制片，必要时应多点取材。如切面有特殊要求，应向技术人员说明。取材和切片的剩余组织须进一步做石蜡切片进行对照，有利于病理医师对照阅片，不断提高观察冰冻切片的水平。（二）保存方法 组织速冻的方法很多，常用方法为液氮和干冰丙酮法。1.液氮法：将组织块平放于瓶盖或标本盒等适当容器内，缓慢放入盛有液氮的容器内。当组织块冻结后，取出用铝箔包好，做好标记后入液氮罐或-70低温冰箱保存。可保存数月至数年。如短期内使用，可保存于-30冰箱。2.干冰-丙酮法：将组织块放入盛有OCT包埋剂的标本盒内，使组织块完全浸没。将丙酮倒入盛有10g干冰的保温杯调成糊状。将装有组织块的标本盒放入保温杯，待包埋剂成白色冻块时，取出如上法保存。此法组织速冻快，组织结构保存好。3.异戊烷-液氮法：此法的优点可防止冰晶破坏组织细胞的形态结构，对含水较多的组织适宜用此法进行速冻。先用甲基纤维素包埋组织块。将盛有异戊烷的小烧杯放入装有液氮的大保温杯或冰壶内，搅拌异戊烷待杯底出现一层白色糊状物时，放入包埋好的组织块，数秒钟即可取出，按上述方法保存。（三）注意事项（三）注意事项 1.液氮速冻时，标本盒不能直接浸入液氮，以免组织膨胀破碎。2.速冻的包埋剂应适量。3.新鲜组织不能放入-10冰箱内缓慢冷却，否则组织内水分可逐渐析出形成冰晶，造成组织结