15遗传性疾病的分子诊断.pptx

分子诊断学分子诊断学 第十五章第十五章 遗传性疾病的分子诊断遗传性疾病的分子诊断 基因工程研究所 南方医科大学 南方医科大学 分子诊断学分子诊断学 教学目的与要求教学目的与要求 了解了解遗传性疾病分子诊断的方法学评价及产前遗传性疾病分子诊断的方法学评价及产前（包括胚胎植入前）遗传缺陷分子诊断的适应症。（包括胚胎植入前）遗传缺陷分子诊断的适应症。熟悉熟悉遗传性疾病的分子机制及分子诊断的标准化。遗传性疾病的分子机制及分子诊断的标准化。掌握掌握遗传性疾病及产前（包括胚胎植入前）遗传遗传性疾病及产前（包括胚胎植入前）遗传缺陷的经典检测方法及临床意义。缺陷的经典检测方法及临床意义。重点重点遗传性疾病及产前（包括胚胎植入前）遗传遗传性疾病及产前（包括胚胎植入前）遗传缺陷的经典检测方法及临床意义。缺陷的经典检测方法及临床意义。难点难点遗传性疾病的分子机制。遗传性疾病的分子机制。南方医科大学 分子诊断学分子诊断学 本章目录本章目录 第一节第一节 遗传性疾病分子诊断的策略遗传性疾病分子诊断的策略*第二节第二节 遗传病的分子诊断遗传病的分子诊断 第三节第三节 产前（包括胚胎植入前）遗传缺产前（包括胚胎植入前）遗传缺陷的分子诊断陷的分子诊断*南方医科大学 分子诊断学分子诊断学 第一节第一节 遗传性疾病分子诊断的策略遗传性疾病分子诊断的策略*一、直接诊断策略一、直接诊断策略 二、基因多态性连锁分析二、基因多态性连锁分析 三、基因突变的定量（三、基因突变的定量（dosage）诊断）诊断 南方医科大学 分子诊断学分子诊断学 一、直接诊断策略一、直接诊断策略 定义：直接检测导致遗传性疾病的各种基因突变定义：直接检测导致遗传性疾病的各种基因突变 类型：点突变类型：点突变 缺失缺失 插入插入 倍增倍增 前提：基因已经克隆，序列和结构清楚前提：基因已经克隆，序列和结构清楚 南方医科大学 分子诊断学分子诊断学 (一)点突变的诊断 1、基因背景清楚的点突变基因背景清楚的点突变 等位基因特异性寡核苷酸杂交(allele specific oligonucleotide,ASO)PCR-ELISA 等位基因特异性扩增(allele specific amplification,ASA PCR-RFLP 测序 基因芯片技术等进行诊断 南方医科大学 分子诊断学分子诊断学 2、基因背景未知的点突变 单链构象多态性(single-strand conformational polymorphism,SSCP)变性梯度凝胶电泳(denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE)异源双链分析(heteroduplex analysis,HA)DNA序列测定 蛋白截短测试（protein truncation test,PTT）南方医科大学 分子诊断学分子诊断学 (二)片段性突变的检测 （1）少数核苷酸缺失或插入 检测点突变的方法（2）大的片段突变 Southern印迹技术、多重PCR技术。片段性突变是指DNA分子较大范围发生突变，碱基的缺失、插入、扩增和重组。南方医科大学 分子诊断学分子诊断学 二、基因多态性连锁分析二、基因多态性连锁分析 检测原理检测原理：多态性连锁分析、关联分析 检测前提检测前提：致病基因尚未被定位和阐明 基因太大 突变种类太多 检测方法检测方法：RFLP，VNTR，STR，SNP 南方医科大学 分子诊断学分子诊断学 三、基因突变的定量诊断三、基因突变的定量诊断 检测方法检测方法：细胞分裂中期染色体检测 固相杂交 PCR 扩增 检测内容检测内容：大范围的重复、缺失 南方医科大学 分子诊断学分子诊断学 方法方法 分辨率分辨率(碱基数碱基数)说明说明 细胞分裂中期染色体检细胞分裂中期染色体检测测 染色体 常规细胞培养至细胞分裂期染色；CGH 5 x 106 细胞分裂中期染色体作为探针来检测和控制不同的杂交；FISH 5 x 104 用修饰（如纤维探针）来增强分辨率；阵列阵列CGH 5 x 104 使用阵列化的细菌人工染色体载体（Bacterial artificial chromosomes，BACs）而非细胞分裂中期染色体作为探针；MAPH 不确定 将探针与基因组DNA杂交，然后再扩增探针；微卫星微卫星PCR 1 x 102 取决于缺失区已知的微卫星；差异差异PCR 1 x 102 要求精心控制起始DNA的质和量，结果为相对量，是一种半定量方法；竞争竞争PCR 1 x 102 准确，结果为摩尔数，是一种绝对定量方法；Real-time PCR 1 x 102 成本较高，可有多种方法如Taqman法或分子信标法的SYBR Green染料或探针，应用越来越广泛；长片段长片段 PCR 1 x 102 检测基因内缺失比重复更有效，可以确定突变的性质。南方医科大学 分子诊断学分子诊断学 第二节第二节 遗传病的分子诊断遗传病的分子诊断 一、血红蛋白病一、血红蛋白病 二、血友病二、血友病 三、肌营养不良症三、肌营养不良症 四、苯丙酮尿症四、苯丙酮尿症 五、囊性纤维化五、囊性纤维化 六、亨廷顿病六、亨廷顿病 七、脆性七、脆性X综合征综合征 南方医科大学 分子诊断学分子诊断学 一、血红蛋白病一、血红蛋白病 血红蛋白具有血红蛋白具有4个亚个亚基组成的四级结构基组成的四级结构，每每个亚基可结合个亚基可结合1 1个血红素个血红素并携带并携带1 1分子氧分子氧。Hb亚基之间通过亚基之间通过8对盐键对盐键，使使4个亚基紧密个亚基紧密结合而形成亲水的球状结合而形成亲水的球状蛋白蛋白。南方医科大学 分子诊断学分子诊断学 珠蛋白基因簇珠蛋白基因簇 16p13.33-p13.11 南方医科大学 分子诊断学分子诊断学 11 15.5 珠蛋白基因簇:南方医科大学 分子诊断学分子诊断学 血红蛋白的类型血红蛋白的类型 成人成人Hb Hb：HbHb A A 2 2 2 2 979798%98%HbHb A A2 2 2 2 2 2 2 23 3%胎儿胎儿HbHb：Hb F Hb F 2 2 2 2 2 2G G2 2 2 2A A2 2 胚胎胚胎HbHb：Hb Gower Hb Gower 2 2 2 2 2 2G G2 2 2 2A A2 2 (妊娠妊娠1212周内周内)Hb Gower Hb Gower 2 2 2 2 Hb Portland Hb Portland 2 2 2 2 南方医科大学 分子诊断学分子诊断学 血血 红红 蛋蛋 白白 类类 型型 南方医科大学 分子诊断学分子诊断学 血红蛋白病血红蛋白病 hemoglobinopathy 结构异常血红蛋白病结构异常血红蛋白病 镰刀状细胞贫血；不稳定血红蛋白病 血红蛋白M病 氧亲和力改变 地中海贫血，地中海贫血，珠蛋白的合成降低或消失 南方医科大学 分子诊断学分子诊断学 1、镰刀形红细胞贫血 正常细胞 镰刀形细胞 镰刀状贫血病血液中大量出现镰刀红细胞，其携带氧的功能只有正常红细胞的一半，患者常因此缺氧窒息。南方医科大学 分子诊断学分子诊断学 N-val his leu thr pro glu glu C(146)HbS 肽链肽链 HbA 肽肽 链链 N-val his leu thr pro val glu C(146)镰刀状细胞贫血分子机制镰刀状细胞贫血分子机制 GTG CAT CTG ACT CCT GAG GAG GTG CAT CTG ACT CCT GTG GAG 南方医科大学 分子诊断学分子诊断学 分子诊断方法分子诊断方法 限制性内切酶法（RE）ASO ARMS、跨越断裂点的PCR(裂口PCR、gap-PCR)南方医科大学 分子诊断学分子诊断学 S 肽链肽链 A肽链肽链 ACT CCT GAG GAG ACT CCT GTG GAG RE法法 (Southern Blot)MstII CC TNA GG GG ANT CC 1.15 kb 0.2 kb 1.35 kb AS S A 南方医科大学 分子诊断学分子诊断学 S 肽链肽链 A肽链肽链 ACT CCT GAG GAG ACT CCT GTG GAG RE法法 (PCR-RFLP)DdeI C TNA G G ANT C 268 bp AS S A 175 bp 175 268 443 南方医科大学 分子诊断学分子诊断学 思考题（作业）书中239页中关于HbE检测请回答下列问题（1）HbE的突变碱基改变情况 (2)该突变位于蛋白质的第几个氨基酸（3）突变位点位于氨基酸哪一个外显子上（4）写出基因组参考序列中此外显子后的内含子序列（5和3端各5个碱基）(5)用MnlI酶切后，请列出各种可能的情况（6）结合所学习的知识，请再写出几种可能用于诊断的方法。南方医科大学 分子诊断学分子诊断学 2.地中海贫血地中海贫血 由于珠蛋白链的合成不平衡所造成的一类常见的单基因遗传性、溶血性疾病。类型：地中海贫血，地中海贫血，地中海贫血，地中海贫血，以此类推。南方医科大学 分子诊断学分子诊断学 地地 中中 海海 贫贫 血血 南方医科大学 分子诊断学分子诊断学 地中海贫血地中海贫血 每条每条1616号染色体上有两个号染色体上有两个GeneGene缺失程度缺失程度不同不同，链合成部分或完全受到抑制链合成部分或完全受到抑制，导致不同类型导致不同类型的地贫的地贫。若一条染色体上缺失一个若一条染色体上缺失一个基因基因（）为为+地贫地贫，链合成减少链合成减少。若一条染色体上两个若一条染色体上两个基因均缺失基因均缺失（）为为0 0地贫地贫，链不能合成链不能合成。南方医科大学 分子诊断学分子诊断学 临床类型临床类型 类类 型型 症症 状状 正常人正常人 静止型静止型 +地贫杂合子地贫杂合子 无症状无症状 轻轻 型型 （标准型）（标准型）0 0地贫杂合子地贫杂合子 轻度贫血轻度贫血 +地贫纯合子地贫纯合子 血红蛋白血红蛋白H H病病 0 0地贫和地贫和+地地贫双重杂合子贫双重杂合子 溶血性贫血溶血性贫血 Hb BartHb Barts s胎胎儿水肿综合征儿水肿综合征 0 0地贫纯合子地贫纯合子 胎儿水肿胎儿水肿 南方医科大学 分子诊断学分子诊断学 胎胎 儿儿 水水 肿肿 南方医科大学 分子诊断学分子诊断学 地贫的分子基础地贫的分子基础 依依基因缺陷程度分为：基因缺陷程度分为：1 1GeneGene缺失型缺失型（缺失缺失1 1个个基因基因）2 2非非GeneGene缺失型（点突变）：无义突变、移码突变、缺失型（点突变）：无义突变、移码突变、终止密码突变、剪接突变等终止密码突变、剪接突变等 结果结果 1 1 生成无功能或稳定性降低的生成无功能或稳定性降低的mRNAmRNA 无义突变无义突变 移码突变移码突变 终止密码突变终止密码突变 起始密码突变起始密码突变 2 2 RNARNA加工突变加工突变 3 3 产生不稳定产生不稳定HbHb 南方医科大学 分子诊断学分子诊断学 地中海贫血的分子机制 南方医科大学 分子诊断学分子诊断学 分子诊断方法分子诊断方法 (1)PCR法 PCR 法已经成为鉴别缺失型 地中海贫血的首选方法。(2)ARMS法 该法能快速鉴别诊断HbC S和HbQ S(3)ASA法 与ARMS 法相类似(4)SSCP法 非缺失型2 地中海贫血突变 (5)等位基因特异性扩增技术(ASPCR）法 南方医科大学 分子诊断学分子诊断学 地中海贫血地中海贫血 珠蛋白珠蛋白GeneGene 突变或缺失突变或缺失珠蛋白链合成速珠蛋白链合成速 率下率下 降降溶血性贫血溶血性贫血 0 0 地贫地贫：链完全不能合成链完全不能合成 +地贫地贫：链可部分合成链可部分合成 南方医科大学 分子诊断学分子诊断学 -地中海贫血临床分类地中海贫血临床分类 临临 床床 类类 型型 基基 因因 型型 基基 因因 产产 物物 临临 床床 表表 现现 重型重型 地贫地贫 +/+、0 0/0 0 0 0/0 0、+/0 0 链几乎不能合成链几乎不能合成 链合成相对增加链合成相对增加 Hb FHb F和和Hb