花椒不同部位提取物抑菌活性及果蔬发病率研究_耿直.pdf

陕西农业科学，（）：，：植物保护花椒不同部位提取物抑菌活性及果蔬发病率研究耿 直（陕西国际商贸学院 医药学院，陕西 咸阳）摘 要：以花椒壳、籽、叶三个部位提取物为供试材料，研究其抑菌活性及对果蔬发病率的影响。采用滤纸片法检测花椒不同部位提取液对大肠埃希菌、沙门氏菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的抑菌活性，通过组织分离法从常见果蔬中分离得到 株病原菌，初步鉴定为曲霉属、青霉属和链格孢属，对分离所得病原菌进行花椒提取物抑菌活性检测。花椒壳提取液的抑菌效果明显高于花椒籽和叶，其中花椒壳提取液对沙门氏菌和金黄色葡萄球菌有良好的抑菌活性，分别为 、。花椒壳、籽、叶对曲霉属、青霉属和链格孢属均有明显的抑菌作用，花椒壳抑菌效果最强，平均抑菌率在 以上，经过花椒壳提取液处理后，果蔬发病率显著降低。结果表明花椒三个部位提取物具有良好的抑菌作用，可作为候选天然植物抗菌剂资源。关键词：花椒提取物；抑菌；果蔬病原菌中图分类号：；文献标识码：文章编号：（）收稿日期：修回日期：作者简介：耿直（），男，陕西西安人。讲师，硕士研究生，研究方向：植物生物技术及生物工程。（，）：，：；花椒是我国传统中药、香料、调味剂，被誉为“八大味之一”。原产于中国，具有赋香、掩盖异味、着色、保健、增加食欲等作用。其壳、籽、茎和叶均可食用和药用，开发前景广。中国药典中记载，花椒有“温中止痛，杀虫止痒”的功效。目前，随着人们对花椒药理作用的深入研究，该植物具有清热驱寒、镇痛、健脾等特殊功效，药效成分主要包括挥发油、生物碱类、酰胺、木脂素、香豆素和黄酮类物质等。花椒中的有效成分在心血管与消化系统疾病治疗以及抗氧化、抑菌、抗炎、镇痛等方面都具有较好的药理作用。近年来，天然植物抑菌剂因其具有低毒、高效、易被降解和对环境污染小等优势，已有替代化学杀菌剂之势，天然抗生素杀菌剂逐渐成为国内外的研究热点。现如今，对花椒的化学成分及应用的相关研究资料较多，而对花椒各部位抑菌活性及对常见果蔬病原菌的抑菌研究相关报道不多。因而笔者对花椒不同部位提取物的抑菌活性研究，为进一步挖掘和开发花椒资源提供参考。材料与方法 材料与试剂花椒壳、籽、叶由四川汉源县农丰种植农民专业合作社提供；乙醇；水为蒸馏水，培养基，培养基。主要仪器摇摆式高速粉碎机（，石岭市大机械有限公司），数控超声波清洗器（，昆山市超声仪器有限公司），立式压力蒸汽灭菌锅（，江阴滨州医疗设备有限公司），回旋式振荡器（，金坛市佳美仪器有限公司）等。花椒不同部位提取液制备将自然晾干的花椒壳、籽、叶粉碎成粗粉备用。分别称取壳、籽、叶粉末各 ，按料液比 （），乙醇浸渍 后超声辅助提取。提取方法：超声温度 ，超声频率为 ，超声提取 后减压抽滤。将滤液浓缩，乙醇定容至，得提取液浓度为 ，置于 冰箱中备用。供试菌制备将 种试验菌大肠埃希菌（，（）、沙门氏菌（，（）、铜绿假单胞菌（，（）、金黄色葡萄球菌（，（）、枯草芽孢杆菌（，（）分别接于 固体培养基上，在 连续培养 后，挑取单菌落于 的 液体培养基中，振荡培养至 为 时，置于 冰箱中备用。花椒不同部位提取液抑菌活性测定采用滤纸片扩散法，在无菌条件下取各供试菌菌悬液 于 固体培养基表面均匀涂布。将无菌空白药敏片于花椒壳、籽、叶的提取液中分别浸泡 后取出，微干后贴于培养基表面。以含药药敏片作为阳性对照，用含无菌水的空白药敏片作为阴性对照。倒置培养 ，每组平行 次重复，以抑菌圈直径作为抑菌活性评价指标。花椒提取物抑菌活性生长曲线测定试验分样品组和空白组。样品组：取培养至单菌落的各供试菌，挑取单菌落于液体 培养基，过夜培养后作为种子液，以 的接种量接于 液体 培养基中，加入一定浓度的花椒提取液。空白组：以不加花椒提取液为空白对照。，振荡培养 ，用紫外 可见分光光度计在 处每隔 测 值。以时间为横坐标，平均值为纵坐标，分别绘制各供试菌生长曲线。果蔬病原菌的分离及初步鉴定采用组织分离法分离果蔬病原菌，取已出现组织腐烂、霉变的果蔬，用少量水迅速冲洗干净，用无菌刀片在腐烂病变与健康部位交界处切取 的组织数块，分别放在少量的酒精中连续浸泡 ，取出，用无菌的滤纸吸干酒精，再依次将其移到 的次氯酸钠溶液中浸泡 ，再用少量的无菌水反复冲洗 次，吸干多余水分，转移至 培养基中，保证果蔬组织与培养基完全接触，恒温无光照培养 。待组织切口处长出菌丝后，挑取尖端形态不同的菌丝至新的 培养基中，通过平板划线法多次分离、纯化，直至菌落的生长状态和形态特点呈现一致，纯化后的菌种，保存。对分离所得病原菌进行菌落形态及菌丝显微观察，初步鉴定各病原菌的种属。花椒不同部位提取液对果蔬病原菌抑菌活性在无菌条件下，用 培养基将花椒各部位提取液分别稀释混匀，制得浓度为 的含药平板，以不含药液的 培养基为空白对照。在典型菌落部位使用直径为 的无菌打孔器制得生长状况和直径一致的菌饼，待平板冷却直至凝固后接入菌饼，每个培养皿接一个菌饼，每个处理需重复 次，于 培养，采用十字交叉法测量菌落直径，计算抑菌率，公式如下：抑菌率 （）（）式中：为空白对照菌落直径（）；为病原菌菌落直径（）；代表接种菌饼的直径（）。耿 直：花椒不同部位提取物抑菌活性及果蔬发病率研究 花椒提取液对果实发病率的影响将圣女果放置于 的次氯酸钠溶液中连续浸泡 、再用少量的蒸馏水反复冲洗后，阴干，备用；在每个圣女果赤道的位置打 相同深度的圆形小孔，于不同浓度的花椒提取液中浸泡 取出，以在无菌水中浸泡 的圣女果为实验空白对照。小孔中依次注入 菌悬液，晾干，保鲜膜封闭培养，分别于第、天观察记录圣女果发病数量，每个处理做 组平行，计算发病率。发病率 （发病或霉变果实个数 果实总数）结果与分析 花椒不同部位提取液抑菌活性测定通过对花椒壳、籽、叶进行提取，采用滤纸片扩散法测定其抑菌活性，以抑菌圈直径大小为测定指标。结果表明：花椒壳提取液对 种供试菌均有抑菌效果，根据图 图 发现花椒不同部位提取液抑菌活性存在较明显差异，其中花椒壳提取液的抑菌效果均高于籽和叶。花椒壳提取液对各供试菌抑菌效果具体表现为金黄色葡萄球菌 沙门氏菌 大肠埃希菌 枯草芽孢杆菌 铜绿假单胞菌。花椒籽提取液对金黄色葡萄球菌的抑菌性较好，其抑菌圈直径达 ，而对铜绿假单胞菌无抑菌活性。花椒叶提取液对枯草芽孢杆菌的抑菌性较好，其抑菌圈直径为 ，而对铜绿假单胞菌无抑菌活性。结果见表，各试验菌阳性对照见表。表 花椒不同部位提取液对 种供试菌的抑菌圈直径供试菌花椒不同部位提取液抑菌圈直径 壳籽叶大肠埃希菌 沙门氏菌 铜绿假单胞菌 金黄色葡萄球菌 枯草芽孢杆菌 注：该结果为三次重复实验结果的平均值，“”表示无抑菌效果。图 花椒提取液对大肠杆菌抑菌活性图 花椒提取液对沙门氏菌抑菌活性图 花椒提取液对铜绿假单胞菌抑菌活性陕西农业科学 年第 卷第 期图 花椒提取液对金黄色葡萄球菌抑菌活性图 花椒提取液对枯草芽孢杆菌抑菌活性注：图中、分别为花椒壳、籽、叶提取液。表 滤纸片扩散法各菌种的阳性对照菌种阳性对照大肠埃希菌庆大霉素沙门氏菌铜绿假单胞菌哌拉西林金黄色葡萄球菌羧苄西林枯草芽孢杆菌青霉素 生长曲线的测定根据滤纸片法结果得出，花椒壳提取液对沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的抑菌效果较为明显，故分别选用该两种菌的最小抑菌浓度（）作为生长曲线测定浓度，即金黄色葡萄球菌的生长曲线测定过程中花椒壳提取液浓度为 ，而沙门氏菌为 。以 液体培养基为空白对照。结果表明：样品组发酵液在 后生长量增加，当培养至 后生长量基本达到稳定，而空白对照的 值在发酵 后始终高于样品组。由此说明，花椒壳提取液对两种菌的生长均有较显著的抑制作用，结果见图。图 花椒壳提取液对金黄色葡萄球菌（）和沙门氏菌（）的生长曲线注：表示金黄色葡萄球菌的生长曲线，花椒壳提取液浓度为 ，表示沙门氏菌的生长曲线，花椒壳提取液浓度为 。耿 直：花椒不同部位提取物抑菌活性及果蔬发病率研究 果蔬病原菌菌种的分离纯化与鉴定从腐烂或霉变后的玉米、圣女果、柑橘、苹果等样本中分离得到 株病原菌，编号分别为、，根据 株病原菌菌落及菌丝显微形态观察，参考真菌鉴定手册和植物病原真菌学初步鉴定其种属，形态学真菌病害诊断特征描述结果见表。表 病原菌菌落及菌丝形态特征菌株菌落形态菌丝和孢子特征鉴定结果菌落黑色粉状，菌落生长较快，背面浅黄色。分生孢子呈放射状，孢子梗无色，小梗为单层，顶囊大球形，分生孢子为球形，黑、褐色。曲霉属（）菌落平坦，菌丝呈丝绒状，中间区域呈绿色，后期出现暗黄绿色、橄榄绿，具白色边缘，呈现圆形椭圆形。典型帚状枝，分生孢子卵形或圆柱形。青霉属（）在孟加拉红培养基上菌落平坦，青色，干燥，边缘白色。生长较快且颜色较深。典型帚状枝，分生孢子呈卵圆形，孢梗茎壁平滑。青霉属（）菌落初为暗绿色或褐色，后至深褐色，边缘白色。分生孢子单生或链生，横膈膜 个。链格孢属（）花椒不同部位提取液对病原菌抑菌活性不同部位的花椒提取液对分离所得病原菌的抑制效果差异较大。其中花椒壳对病原菌的抑菌作用效果突出，抑菌率均可控制在 以上，对曲霉属的抑菌作用效果尤为显著；花椒籽提取液的抑菌率可达 以上，对链格孢属抑菌效率较高；花椒叶提取液对各病原菌抑菌作用均不显著，结果见图，表。表 花椒不同部位提取液对 种病原菌的抑菌效果（）曲霉属（）青霉属（）链格孢属（）菌落直径 抑菌率 菌丝直径 抑菌率 菌丝直径 抑菌率 花椒籽 花椒壳 花椒叶 空白 注：同列不同字母表示差异显著（）。花椒壳提取液对果蔬发病率的影响将分离所得病原菌接入健康圣女果中，结果显示发病率明显迅速上升，在第 天，果实发病率均可达到 ，第 天已达 。采用不同浓度的花椒壳提取液处理之后，果实发病率得到明显的降低，第 天时果实发病率分别比空白对照组下降了 、，在第 天时果实发病率分别比对照组下降了 、，说明了花椒壳提取液对侵染圣女果的曲霉属、青霉属、链格孢属仍有较强的抑制作用，进一步证明其对圣女果采后有较好的防腐保鲜作用，结果见图。陕西农业科学 年第 卷第 期 曲霉属（）青霉属（）链格孢属（）图 花椒不同部位提取液对不同病原菌的抑制效果图 花椒壳提取液对果实发病率的影响注：为曲霉属发病率；为青霉属发病率；为链格孢属发病率，对应花椒壳提取液分别为 、。（下转第 页）耿 直：花椒不同部位提取物抑菌活性及果蔬发病率研究 陈太春，冯志珍，张国龙，等 不同药剂处理对红薯地下害虫田间防效研究 黑龙江农业科学，（）：闫嘉琦，许震宇，姜欢洪，等 克 升噻呋酰胺悬浮剂对马铃薯黑痣病防治效果及产量影响吉林农业：下半月，（）：张友青，李东风，李小龙，等 白僵菌对花生地下害虫的防治效果试验 中国植保导刊创刊 周年 暨 绿 色 植 保 高 层 论 坛中 国 植 物 病 理 学会，陆建珍，汪翔，秦建军，等 我国甘薯种植业发展状况调查报告（年）基于国家甘薯产业技术体系产业经济固定观察点数据的分析 江苏农业科学，（）：蒋玉峰，马代夫 国家甘薯产业技术体系建设推动甘薯产业和学科发展 江苏师范大学学报（自然科学版），（）：高志远，胡亚亚，刘兰服，等 甘薯连作对根际土壤微生物群落结构的影响 核农学报，（）：赵永强，杨冬静，孙厚俊，等 拔苗和剪苗对甘薯黑痣病发生的影响 安徽农业科学，（）：陈慧，王会芳，陈绵才 象耳豆茎线虫的研究进展 贵州农业科学，（）：吴青松 南方茎线虫对噻唑膦的抗药性分析及其抗性治 理 策 略 初 探 北 京：中 国 农 业 科 学院，（）：张友青，李东风，李小龙，等 白僵菌对花生地下害虫的防治效果试验 中国植保导刊创刊 周年 暨 绿 色 植 保 高 层 论 坛中 国 植 物 病 理 学会，（上接第 页）结论通过对花椒壳、籽、叶提取物的抑菌活性研究，结果发现花椒壳、籽、叶提取物对 种试验菌及分离所得果蔬常见病原菌均有不同程度的抑菌活性，抑菌活性表现为花椒壳 花椒籽 花椒叶。其中花椒壳提取液对沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的抑菌效果较好。花椒壳提取液对沙门氏菌的抑菌圈直径为 ，为 ，而花椒壳提取液对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径为 ，为 。同时花椒不同部位提取液对从常见果蔬中分离得到的 种果蔬病原菌抑菌效果差异显著，具