AFLP原理和操作步骤AFLP是通过限制性内切酶片段的不同长度检测DNA多态性的一种DNA分子标记技术。本AFLP技术主要特点：分析所需DNA量少，仅需0.5g；可重复性好；多态性强；分辨率高；不需要Southern杂交；样品适用性广；稳定的遗传性。在技术特点上，AFLP实际上是RAPD和RFLP相结合的一种产物。它既克服了RFLP技术复杂、有放射性危害和RAPD稳定性差，标记呈现隐性遗传的缺点，同时又兼有二者之长。近几年来，人们不断将这一技术完善、发展，使得AFLP迅速成为迄今为止最有效的分子。一、AFLP原理AFLP也是通过限制性内切酶片段的不同长度检测DNA多态性的一种DNA分子标记技术。但AFLP是通过PCR反应先把酶切片段扩增，然后把扩增的酶切片段在高分辨率的顺序分析胶上进行电泳，多态性即以扩增片段的长度不同被检测出来。实验中酶切片段首先与含有与其共同粘末端的人工接头连接，连接后的粘末端顺序和接头顺序就作为以后PCR反应的引物结合位点。实验中，根据需要通过选择在末端上分别填加了1～3个选择性核苷的不同引物，可以达到选择性扩增的目的。这些选择性核苷酸使得引物能选择性地识别具有特异配对顺序的内切酶片段，进行结合，导致特异性扩增。二、实验试剂Taq酶、EcoRI/MseIEcoRI/MseI接头、E+A引物M+C引物、T4DNALigaseE和M引物、琼脂、过硫酸胺、丙烯酰胺、尿素、硝酸银、甲酰胺、dNTPs、二甲苯青、冰醋酸、玻璃硅烷、50bpMark三、操作步骤（一）基因组DNA提取和纯化参考DNA实验方法DNA的纯化：用0.8%琼脂糖凝胶（含EB0.5μg/ml）电泳检测片段大小，取出其中的1/3已提取的基因组DNA进行纯化，首先用TE缓冲液补满至总体积50ul，再等体积苯酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）、氯仿/异戊醇（24∶1）各抽提一次，离心吸上清液于Eppendorf管中，加入1/10体积的NaAC和二倍体积预冷的无水乙醇，－20℃放置2h以上，10000g离心10min，用70%的乙醇漂洗DNA沉淀2次，风干后溶于30μlTE缓冲液中，UV-2401PC（岛津）紫外分光光度计检测A260、A280值并定量，再用0.8%琼脂糖凝胶（含EB0.5μg/ml）电泳检测片段大小。注：0.1-0.2g组织可用100ul溶液E溶，0.5g组织，溶液E可增加至300ul，此时DNA浓度大约为100ng/ul。（二）限制性酶切及连接在0.2ml离心管中加入：模板量约为250ng，2.5μl10×酶切缓冲液，2.5μl10×T4DNA连接酶切缓冲液，5UEcoRⅠ，5UMseⅠ，2UT4连接酶，50pmolMseⅠ接头，双蒸水补至25μl。用PE公司PCR扩增仪设定37℃过夜反应后，于65℃20min灭酶活，－20...
