浙江省第四届大学生生命科学学科竞赛实验记录序号：6实验时间：7月16日—7月18日鲍曼不动杆菌基因组DNA提取【实验目的】1、掌握细菌基因组DNA提取的原理和方法；2、掌握琼脂糖凝胶电泳检测核酸的原理和操作；【实验原理】一、基因组DNA提取：细菌的核酸分为两类：DNA和RNA，DNA主要存在于染色体中，RNA主要存在于细胞质中。因此，制备DNA的原则是既要将DNA与蛋白质、脂类和糖类等分离，又要保持DNA分子的完整。提取DNA的一般过程是经阴离子去污剂结合蛋白酶裂解细菌之后，利用CATB，酚抽提法去除多糖、蛋白质、RNA等杂质，并选择性沉淀得到较纯DNA。提取DNA的反应体系中，SDS（十二烷基硫酸钠）是一种阴离子去污剂，在高温（55-65℃）条件下能裂解细胞，使染色体离析，蛋白变性，释放出核酸；EDTA可抑制细胞中Dnase的活性；苯酚作为蛋白变性剂，同时抑制了DNase的降解作用，反复抽提，使蛋白质变性沉淀于水相和有机相之间。苯酚、氯仿抽提可以彻底去除蛋白质，醇沉淀可以去除盐。对于一般的样品（杂质为蛋白质），该方法完全可以获得高质量的核酸。二、琼脂糖凝胶电泳：琼脂糖凝胶电泳技术（agarosegelelectroghoresis）是分离、鉴定和提纯DNA片断的有效方法。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时具有电荷效应与分子筛效应。它首先利用琼脂糖凝胶的分子筛效应，将大小不同的片段分离开来；此外，在弱碱性条件下，DNA分子带负电荷，从负极向正极移动。根据DNA分子大小、结构及所带电荷的不同，它们以不同的速率通过介质运动而相互分离。借助溴化乙锭（EB）能与双链DNA结合的作用，利用EB染色，并通过紫外线激发即可观察被分离DNA片段的位置。根据荧光的位置，可区分不同的核酸带。还可判定核酸制品的完整性。基因组DNA片段的分子量很大，在电场中泳动很慢，如果发生降解，电泳图呈拖尾状。【实验材料】1、实验菌株：从××医院临床分离的11株鲍曼不动杆菌B20-B30。2、实验试剂：LB液体培养基、STE缓冲液（0.1mol/LNaCl，10mmol/LTris-HCl，10mmol/LEDTA）、GTE缓冲液（50mmol/L葡萄糖，25mmol/LTris-HCl，10mmol/LEDTA）、TE缓冲液（PH8.0）（10mmol/LTris-HCl，1mmol/LEDTA）、5mol/LNaCl、2%SDS、100mg/mL溶菌酶、10mg/mLRNaseA、Tris-饱和酚（Tris-phenol）、氯仿（chloroform）、无水乙醇（Ethanol）、NormalRunTM1kb-ⅡqDL10002、1×TAE电泳缓冲液、溴化乙锭水溶液（10mg/mL）、上样缓冲液（6×loadingbuffer）。3、实验仪器：安泰超净工作台、指针式...
