解螺旋陪伴医生科研成长http://www.helixlife.cn1核糖体亲和沉淀测序1.实验原理为了系统的分析调节因子，我们计划：分别采用核糖体亲和沉淀测序（translatingribosomeaffinitypurification-sequencing,TRAP-seq）和磷酸化核糖体亲和沉淀测序（pTRAP-seq），比较两者的差异，即可快速分析XX刺激前后的基因表达差异，获得被激活或抑制的基因列表。通过p-TRAP，进一步验证其与cFos共定位率，一般超过60%认为是激活或抑制基因。我们计划采用类似的策略来寻找YY刺激所激活或者抑制基因。2.实验目的寻找特异性激活基因。3.实验材料3.1主要试剂CycloheximideStock(1000x),DHPC,HEPES,Kcl,MgCl2,DTT,ProteaseandP’taseInhibitorCocktail,RNAsinprogmega,Cycloheximide,Superasin，RLTbuffer（Qiagen）等。解螺旋http://www.helixlife.cn/3.2主要仪器BEADS,Falcon管，冰冻离心机，移液器等。4.实验步骤1.Beads准备，ProteinL,+Beads孵育一小时，PBS水清洗30min，+抗体孵育一小时。2.组织标本匀浆，建议使用玻璃制匀浆搅拌棒，离心（2000xg4度10min），取上清，加入NP40和DHPC水，冰上静置10min，离心20min，去上清为S20（Input），取其中50uL，加入RLTbuffer（Qiagen），其余加入Beads中，作为IP。解螺旋陪伴医生科研成长http://www.helixlife.cn23.提取RNA步骤于常规RNA提取相似（注意Qiagen的Kit有特殊的洗液，RW1和RPF，参考Qiagen的Protocol），建议使用Qiagen的RNA离心柱提取。5.参考文献1-31.OuwengaR,LakeAM,O'BrienD,MoghaA,DaniA,DoughertyJD.TranscriptomicAnalysisofRibosome-BoundmRNAinCorticalNeuritesInVivo.JNeurosci2017;37(36):8688-705.2.ThomsonSR,SeoSS,BarnesSA,etal.Cell-Type-SpecificTranslationProfilingRevealsaNovelStrategyforTreatingFragileXSyndrome.Neuron2017;95(3):550-63e5.3.VragovicK,BartomE,Savaldi-GoldsteinS.QuantitationofCellType-SpecificResponsestoBrassinosteroidbyDeepSequencingofPolysome-AssociatedPolyadenylatedRNA.MethodsMolBiol2017;1564:81-102.解螺旋http://www.helixlife.cn/
