HighResolutionMelting高分辨率熔解曲线实验优化建议pictureplaceholderApplicationSupportCenterRocheAppliedScienceHotline:8008200577Email:asc.support@roche.comHRM实验优化的核心饱和双链DNA结合染料减少非特异性产物和引物二聚体2引物模板Mg2+PCR程序3HRM实验优化–引物•引物设计–引物退火温度Tm~60oC–扩增片段长度<250bp，通常在100-150bp左右–使用专业的引物设计软件；利用BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)来确保引物与模板DNA结合的特异性•引物纯度–使用HPLC纯化级别的高纯度引物•引物浓度–为了避免引物二聚体的生成，使用较低的引物浓度：例如200nMeachHRM实验优化–模板•核酸提取–确保所有样品的提纯方法都是一样的–使用高质量的核酸提纯方法。例如：商业化的手动核酸提取试剂盒或者全自动核酸提取仪•模板浓度–建议模板起始浓度在5-30ng/20ul，扩增曲线的Cp值<30–用吸光度方法计算待测样品的核酸浓度，调整模板浓度使它们的起始浓度相同45HRM实验优化–Mg2+浓度优化167bpPCRFragmentMgCl2Titration1.0–4.0mMPCRPrimers:200nMeachTouchdownPCRProtocol(64–54°C)6HRM实验优化–Mg2+浓度优化MWMPCRProducts(+NTC4.0mM)MWM50bp4.04.03.53.02.52.01.51.050bpMgCl2ConcentrationAgaroseGel2%TouchdownPCR•用于：当无法进一步调节引物退火温度时•原理：先在较高的温度退火，保证产物的特异性；在后面的循环中，退火温度逐渐降低，保证有足够的产物总量•局限性：TouchdownPCR不适用于定量实验78TouchdownPCRExample1:TouchdownPCRwith40Cyclesand0.5°Cstepsize9TouchdownPCRExample2:TouchdownPCRwith45Cyclesand1°Cstepsize在LCNano中编辑TouchdownPCR10COLD-PCR:COamplificationatLowerDenaturationTemperature•问题：丰度低的突变基因在PCR扩增中很难被检测到•解决方法：选择性的扩增突变序列•FastCOLDPCR原理：–适用于G/C→A/T的突变，Tm(wt)>Tm(mut)–变性温度设在Tm(mut)附近，保证在这个温度下只有突变型发生变性11COLD-PCR:COamplificationatLowerDenaturationTemperature•实验必备条件:–精确的温度控制–孔间温差尽量小，保证样品中突变型扩增的富集程度一致•其他应用：–FastCOLD-PCR：优先扩增Tm低于野生型homoduplexes，适用于(G/C→A/T,占突变的84%)–FullCOLD-PCR：优先扩增heteroduplexes,适用于所有突变–Ice-COLD-PCR：与FullCOLD-PCR相同,但使用了referencesequence(RS)oligo,提高het...
