8+微生物的遗传育种.ppt

第九章微生物的遗传育种,一、几个基本概念,遗传(heredity)：生物的上一代将自己的一整套遗传因子传递给下一代的行为或功能，具有极其稳定的特性。遗传型（或基因型）(genotype)：某一生物个体所含有的全部遗传因子即基因的总和。,表型(phenotype)：某一生物体所具有的一切外表特征及内在特性的总和，是遗传型在合适环境下的具体表现。遗传型+环境条件 表型变异(variation)：生物体在某种外因或内因的作用下所引起的遗传物质结构或数量的改变，即遗传型的改变。,饰变(modification)：不涉及遗传物质结构改变，而只发生在转录、转译水平上的表型变化。饰变是不遗传的。,二、遗传变异的物质基础,三个经典实验肺炎链球菌的转化实验噬菌体的感染实验植物病毒的重建实验,1、Discovery of bacterial transformation（转化）,1928，Fred Griffith discovered the phenomenon of transformation in Streptococcus pneumoniae（肺炎链球菌）He proposed the concept of transforming principle.,?,Discovery of DNA as genetic material（一）,细菌培养试验热死S菌 培养皿培养 不生长活R菌 培养皿培养 长出R菌热死S菌+活R菌 培养皿培养 长出大量R菌及10-6S菌,S型菌的无细胞抽提液试验活R菌+S菌无细胞抽提液 培养皿培养 长出大量R菌和少量S菌,Discovery of DNA as genetic material（二）,+S DNA+S DNA及DNA酶以外的酶+S DNA和DNA酶 Live R+S RNA+S protein+S capsule polysaccharide,Live S,Live R,1944,O.T.Avery,C.M.Macleod and M.McCarty discovered the genetic material-DNA,2、Phage infection,1952,Hershey and Chase,demonstrated conclusively that DNA is the genetic material by using radioactively labeled phage virus T2 as experimental modelPhage infectionAttachment to cell surfaceInjection of genetic materials into host cellDirect the host cell to make new virus particles,3、TMV重建实验,1956，H.Fraenkel-Conrat,TMV:烟草花叶病毒;HRV:霍氏车前花叶病毒,核酸在胞内存在的七个水平,细胞水平：单细胞与多细胞、性细胞与体细胞、单核与多核细胞；细胞核水平：真核与原核、核内与核外、单核与多核等；染色体水平：一套染色体、多套染色体、染色体基因组的大小等；,核酸水平：是DNA还是RNA、是复合还是裸露、是长还是短等；基因水平：依基因功能可分为结构基因及调控基因等；密码子水平：结构密码子、起始与终止密码子等；碱基水平：突变的最低交换单位有A、T、G、C等。,三、基因突变（Gene mutation）,基因突变（突变）：生物体内遗传物质的分子结构突然发生的可遗传的变化，突变几率一般为10-610-9。突变率：每一细胞在每一世代中发生某一性状突变的几率。突变一般是独立发生的，双重突变的几率是各个突变几率的乘积。,1、基因突变的特点,自发性：突变可以在没有人为的诱变因素处理下自发产生。稀有性：突变率极低。独立性：突变的发生一般是独立的。,诱变性：通过诱变剂的作用提高自发突变几率。稳定性：新的诱变性状是稳定的、可遗传的。可逆性：野生型基因 突变型基因不对称性：突变性状与引起突变的原因间无直接的对应关系。,2、基因突变的自发性与不对称性的证明,变量试验（fluctuation test）：1943年，S.E.Luria和M.Delbrck涂布试验（newcombe experiment）1949年，Newcombe平板影印培养试验（replica plating）1952年，J.Lederberg,3、突变类型,形态突变型(morphological mutant)产量突变型(producing mutant)抗原突变型(antigenic mutant)：因突变而抗原结构发生改变的突变型。条件致死突变型(conditional lethal mutant)：突变后在某种条件下可以正常生长繁殖，而在另一条件下无法生长繁殖的突变型。抗性突变型(resistant mutant)：因突变产生了对某种化学药物或者物理致死因子抗性的突变型。营养缺陷型(auxotroph),营养缺陷型,营养缺陷型：野生型菌株因发生基因突变而丧失合成一种或几种生长因子、碱基或氨基酸的能力，因而无法在基本培养基上正常生长繁殖的变异类型。野生型(wild type)：从自然界分离到的在发生人为营养缺陷突变前的原始菌株。原养型(prototroph)：营养缺陷型突变株经回变或重组后产生的菌株，其营养要求在表型上与野生型相同。,4、诱变剂,诱变剂(mutagen)：能诱发生物基因突变，并且突变频率远远超过自发突变率的物理因子或化学物质。物理诱变剂（紫外线、激光、电子束、X射线、射线、快中子）化学诱变剂（碱基类似物、烷化剂、移码突变剂、脱氨 剂、羟化剂）,UV对DNA的损伤及其修复,UV的作用机制：使同链DNA的相邻嘧啶形成共价结合的嘧啶二聚体，减弱双链间氢键的作用，并引起双链结构扭曲变形，阻碍碱基间的正常配对，从而有可能引起突变或死亡。,光复活作用：把经UV照射后的微生物立即暴露于可见光下时，可明显降低其死亡率的现象。所以在进行紫外线诱变育种时，只能在红光下进行照射和后续操作，并在黑暗条件下培养。光解酶,暗修复作用（切除修复）：活细胞内一种用于修复被UV等诱变剂（包括烷化剂、X射线和射线等）损伤后的DNA的机制。内切核酸酶外切核酸酶DNA聚合酶DNA连接酶,四、诱变与育种,（一）自发突变与育种 1、从生产中育种 10-6突变率-寻找正向突变株 2、定向培育优良菌株一种利用微生物的自发突变，并采用特定的选择条件，通过对微生物群体不断移植以选育出较优良菌株的古老方法。牛型结核杆菌-13年-230代-卡介苗（减毒的活菌疫苗）,（二）诱变育种,利用物理、化学等诱变剂处理均匀而分散的微生物细胞群，促进其突变率显著提高，然后采用简便、快速和高效的筛选方法，从中挑选少数符合目的的突变株。诱变+筛选,诱变育种的基本环节,诱变育种步骤,选择简便有效的诱变剂物理诱变剂：UV、激光；X射线、射线和快中子化学诱变剂：烷化剂、碱基类似物和丫啶类化合物挑选优良的出发菌株（诱变育种选用的初始菌株）对诱变剂敏感性高具有特定性状的能力或者潜能,处理单孢子（或单细胞）悬液 要求：菌体处于对数生长期细菌分散且为单细胞4.选用最适的诱变剂量UV剂量指强度与作用时间的乘积；常以杀菌率作为诱变剂的相对剂量；多采用杀菌率为7075%甚至更低（3070%）的相对剂量。,充分利用复合处理的协同效应设计或采用高效筛选方案或方法初筛：以量为主，利用和创造形态、生理与产量间的相关指标，可在培养皿或摇瓶中进行。平皿快速检测法复筛：以质为主，一般采用摇瓶培养或台式发酵罐进行发酵，然后对培养液进行分析测定，选出较理想的菌种。摇瓶法,五、3类突变株的筛选方法,（一）产量突变株的筛选（二）抗药突变株的筛选（三）营养缺陷型突变株的筛选,（一）产量突变株的筛选,琼脂块培养法（春日霉素高产菌的筛选）,（二）抗药突变株的筛选,（三）营养缺陷型突变株的筛选,几个基本概念基本培养基（minimal medium，MM）：仅能满足某微生物的野生型菌株生长需要的最低成分组合培养基。完全培养基（complete medium，CM）：凡可满足一切营养缺陷型菌株营养需要的天然或半组合培养基。补充培养基（supplemental medium，SM）：凡只能满足相应的营养缺陷型生长需要的组合培养基。,筛选步骤,第一步：诱变剂处理第二步：淘汰野生型，“浓缩”营养缺陷型抗生素法：野生型菌株在MM生长+抗生素，死亡；缺陷型菌株在MM培养基不生长+抗生素，仍然存活。细菌：青霉素法真菌：制霉菌素法菌丝过滤法：野生型在基本培养基上发育成菌丝；缺陷型不萌发可通过滤膜，野生型菌丝不能通过。丝状菌（真菌或放线菌）,第三步：检出缺陷型逐个检出法影印平板法夹层培养法限量补充培养法（+0.01%蛋白胨，大菌落为营养缺陷型）第四步：鉴定缺陷型：生长谱法,六、基因重组（Gene recombination）,基因重组（或遗传重组）：两个独立基因组内的遗传基因，通过一定的途径转移到一起，形成新的稳定基因组的过程。原核微生物的基因重组：转化、转导、接合、原生质体融合等。真核微生物的基因重组：有性杂交、准性杂交、转化、原生质体融合等。,1、Transformation（转化）,转化：受体菌（recipient cell）直接吸收供体菌（donor cell）的DNA片段，通过交换，把它整合到自己的基因组中，而获得部分新的遗传性状的现象。转化子（transformant）：通过转化方式而形成的杂种后代。感受态：受体细胞最易接受外源DNA片段并能实现转化的一种生理状态。,转化的条件,两个菌株间的亲缘关系密切；受体细胞要处于感受态；供体DNA片段大小合适，分子一般106D，15个基因左右；单链供体DNA进入受体菌，发生同源重组；DNA复制，受体细胞分裂，带有新形状的个体为转化子。,2、Transduction（转导）,转导：通过完全缺陷或部分缺陷噬菌体的媒介，把供体细胞的小片段DNA携带到受体细胞中，通过交换和整合，使后者获得前者部分遗传性状的现象。,Generalized transduction（普遍转导）,定义：通过极少数完全缺陷噬菌体对供体菌基因组上任何小片段DNA进行“误包”，而将其遗传性状传递给受体菌的现象。媒介：温和噬菌体方式完全普遍转导流产普遍转导,Specialized transduction（局限转导）,定义：通过部分缺陷的温和噬菌体把供体菌的少数特定基因携带到受体菌中，并与后者的基因组整合、重组，形成转导子的现象。缺陷噬菌体的形成方式：脱离宿主核染色体时，发生低频率的误切。,3、Conjugation（接合）,定义：供体菌（“雄”）通过其性菌毛与受体菌（“雌”）直接接触，把F质粒或其携带的不同长度的核基因组片段传递给后者，使后者获得若干新遗传性状的现象。四种不同接合型菌株F+菌株（雄性菌株）F-菌株（雌性菌株）Hfr菌株（高频重组菌株）F菌株,4、原生质体融合（Protoplast fusion）,原生质体融合：通过人为的方法，使遗传性状不同的两个细胞的原生质体发生融合，借以获得兼有双亲遗传性状的稳定重组子的过程。,5、有性杂交（Sexual hybridization）,有性杂交：不同遗传型的两性细胞间发生的接合和随之进行的染色体重组，进而产生新遗传型后代的一种育种技术。,6、准性杂交（Parasexual hybridization）,准性杂交：同种生物两个不同菌株的体细胞发生融合，且不以减数分裂的方式而导致低频率的基因重组并产生重组子。,准性生殖与有性生殖的比较 项 目 准性生殖 参与接合的亲本细胞 形态相同的体细胞 形态或生理上有分化的性细胞 独立生活的异核体阶段 有 无接合后双倍体的细胞形态 与单倍体基本相同 与单倍体明显不同双倍体变为单倍体的途径 通过有丝分裂 通过减数分裂 接合发生的几率 偶然发现，几率低 正常出现，几率高,七、基因工程（Gene engineering）,利用分子生物学的理论和技术，自觉设计、操纵、改造和重建细胞的遗传核心-基因组，从而使生物体的遗传性状发生定向变异，以最大限度地满足人类活动的需要。,1、Genetic Engineering Procedures,Isolation and fragmentation of the source DNAJoining the DNA fragments to a cloning vector with DNA ligaseIncorporation into a hostDetection and purification of the desired cloneProduction of large numbers of cells or bacteriophage containing the desired clone for isolation and study of the clone DNA,2、Cloning Vectors-Plasmids,1、Small,only 4361 BP,Stable in E.coli2、High copy number(1000-3000 copies per cell)3、Easily isolated in the supercoiled form4、Foreign DNA can be inserted in good amount5、Restriction sites are known6、Single cleavage sites for several restriction enzymes7、Two antibiotic resistance markers8、Transformation easy,Plasmid pBR322,Gene cloning and Expression using Plasmid pBR322,cloning vectors-Hosts,Ideal hosts:rapid growth,capable of growth in cheap culture medium,not harmful or pathogenic,transformable by DNA,stable.Prokaryotic hosts:E.coli,Bacillus subtilis.Eukaryotic hosts:Saccharomyces cerevisiae.virusDNA virus SV40,a virus causing tumors in primates,can be used as a cloning vector into human culture lines.Retroviruses,vaccinia virus are useful too.Baculovirus,an insect DNA virus can be used to transfer DNA to insect cell lines,3、Finding the right clones,(a)Detecting production of protein by use of specific antibody(b)Detecting recombinant clones by colony hybridization with radioactive nucleic acid probe,5、Practical Applications of Genetic Engineering,Microbial fermentations:antibiotics,enzymes,proteins,biopolymers(PHA)etc.Virus vaccines:expression of virus protein coats.Mammalian proteins:cloning and expression of human proteins in bacteria.Transgenic plants and animals:improve growth rates and yields,as well as new properties for new species.Environmental biotechnology:clone new genes for degradation of synthesized compounds.Gene regulation and gene therapy:antisense RNA,ribosymes,genetic engineering to treat genetic diseases,八、菌种的衰退,正变 菌种进化（个别）进化性变异 负变 菌种衰退（大量）退化性变异菌种衰退的表现菌落和细胞形态的改变；生长速度缓慢，产孢子越来越少；代谢产物生产能力或其对宿主寄生能力的下降；抗不良环境条件能力的减弱。,自发突变,菌种衰退的防止控制传代次数，采用有效的菌种保藏方法创造良好的培养条件利用不同类型的细胞进行接种传代,菌种复壮,狭义：在菌种已发生衰退的情况下，通过纯种分离和测定生产性能等方法，从衰退的群体中找出少数尚未衰退的个体，以达到恢复该菌原有典型性状的一种措施。广义：在菌种的生产性能尚未衰退前，就经常有意识地进行纯种分离和生产性能的测定工作，以期菌种的生产性能逐步有所提高。,菌种复壮的方法纯种分离：平板表面涂布法、平板划线分离法、琼脂培养基浇注法通过宿主体内生长进行复壮淘汰已衰退的个体,菌种保藏,挑选典型菌种或者典型培养物的优良纯种，最好保藏它们的分生孢子、芽孢等休眠体；创造有利用长期休眠的良好环境，例如干燥、低温、缺氧、避光、缺乏营养以及添加保护剂或者酸度中和剂等。代表性的菌种保藏机构：中国微生物菌种保藏委员会（CCCCM），中国典型培养物保藏中心（CCTCC），美国典型菌种保藏中心（ATCC）,菌种保藏,斜面冰箱保藏法：将菌种接在适当的斜面上，待其生长丰满后，放入4冰箱中保藏。半固体穿刺保藏法：将菌种接入半固体直立柱中，进行培养，待长好后，放入4冰箱中保藏。石蜡油封存法：将无菌石蜡油加入到上述保藏菌种中，隔绝空气，则效果较好；如用灭菌的橡皮塞代替棉花塞，则效果更好。,砂土管保藏法：取过筛（60目）河砂，用10%HCl浸泡，用水洗净后，烘干，再取瘦土，以41混合，装入小试管，灭菌后，滴入几滴菌悬液，搅匀，抽气干燥，放入低温处保藏。冷冻干燥保藏法：将用灭菌牛奶制成的高浓度菌液装入灭菌的安瓿瓶中，放入低温条件下抽气干燥，使其中水分因升华作用逸出，形成完全干燥的菌块，然后将安剖瓶在真空条件下融封。,七种常用保藏方法的比较,Infection of host cell by T2 phage,Isolation of Mutants,Pigmented and nonpigmented mutantsAntibiotic-resistant mutants within the inhibition zoneGenetic marker,such as the expression of b-galactosidase that produces the blue color,暗修复,诱变剂量,筛选方法,抗生素法,菌丝过滤法,夹层培养法,Replica Plating Technique:Isolation of Mutants,Complete medium,Minimal medium,逐个检出法,生长谱法,方法简便；回变和污染不影响 结果 测定物质可为粉末 或纸片,测定一般应分两阶段：第一阶段：测定是哪类物质的缺陷型；第二节段：根据第一阶段确定的范围，进一步确定是哪种具体化合物的缺陷型；,Transformation,Mechanism of transformation（一）,Mechanism of transformation（二）,Transduction,