第四部分浅尝现代生物技术实验12乳酸脱氢酶同工酶的分离浙科版选修1实验原理•关于垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳•关于连续系统和不连续系统•关于乳酸脱氢酶同工酶及酶活性染色垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳•电泳带电颗粒在电场的作用下，向着与其电性相反的电极方向移动，这种现象称之为电泳。•聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(Acr)和交联剂N,N’-亚甲基双丙烯酰胺(Bis)在催化剂过硫酸铵(AP)和加速剂N,N,N’,N’-四甲基乙二胺(TEMED)作用下聚合交联而成的三维网状结构的凝胶，通过改变凝胶浓度及交联度来调节凝胶的孔径，具有良好的分子筛效应。它已成为目前生化实验室最常用的支持介质。以它为支持物发展起来的各种聚丙烯酰胺凝胶电泳技术，不仅能分离、小量制备生物大分子，而且可以用来研究生物大分子的性质如电荷、相对分子质量、等电点以及构象等。•垂直板电泳将配制好的凝胶溶液注入到两块垂直放置的玻璃板之间聚胶，然后加样进行电泳。AP-TMTED催化体系•TEMED催化AP生成硫酸自由基：S2O82－2SO4·¯•硫酸自由基的氧原子激活Acr单体并形成单体长链：•Bis将单体长链间连成网状结构：化学聚合的凝胶孔径较小，常用于制备分离胶，重复性好。聚合反应受各种因素的影响：•催化剂和加速剂的浓度应选择合适的AP和TEMED浓度使聚合时间控制在30—60min内较好，过量的催化剂和加速剂会引起烧胶和蛋白质条带的畸变。•pHTEMED只能以游离碱的形式发挥作用，在酸性条件下，叔胺缺少自由碱基，引发AP产生自由基的过程会被延迟，聚合时间延长。•温度聚合速度与温度有关，一般是高温聚合快，而聚合的速度影响交联孔径的大小，所以凝胶聚合时必须保持温度恒定，通常用与电泳相同的温度。•分子氧分子氧的存在会阻止碳链的延长，妨碍聚合作用，在聚合过程中要尽量避免接触空气。•杂质某些金属离子或其它杂质也会影响凝胶的化学聚合，所以应选择高纯度的Acr、Bis和AP。凝胶总浓度及交联度对凝胶的影响•凝胶溶液中单体和交联剂的总浓度和两者的比例是决定聚丙烯酰胺凝胶特性包括其机械性能、弹性、透明度、粘着度及孔径大小的主要因素。T为凝胶溶液中单体和交联剂的总质量浓度，C为凝胶溶液中交联剂占单体和交联剂总量的质量分数。式中，a为丙烯酰胺单体的质量(g)，b为交联剂的质量(g)，m为溶液的终体积(mL)。•凝胶a、b的比例决定了凝胶的物理性状。当a:b小于10时，凝胶脆且硬，不透明，呈乳白色；当a:b大于100时，即使用5%的丙烯酰胺凝胶也呈糊状；通常用a:...
