规模化猪场猪伪狂犬病和猪繁殖与呼吸综合征的诊断及防控效果评估.pdf

12023.11试验研究0 引言猪伪狂犬病病毒主要侵害呼吸系统和神经系统，临床上主要表现为震颤、嗜睡、呼吸困难、生长缓慢1，新生仔猪发病率和死亡率高。该病无明显的季节性特收稿日期：2023-09-12基金项目：2020年度郑洛新国家自主创新示范区创新引领型产业集群专项：猪伪狂犬病、猪圆环和猪肺炎支原体基因工程疫苗的研发与产业化（201200211200）作者简介：郭玲花（1987-），女，河南濮阳人，本科，工程师，从事动物疫病诊断和疫苗研究。*通信作者简介：田克恭（1964-），男，博士，研究员，从事动物疫病诊断和疫苗研究。*通信作者简介：张云静（1989-），男，硕士，兽医师，从事动物疫病诊断和疫苗研究。*通信作者简介：逄文强（1983-），男，博士，工程师，从事动物疫病诊断和疫苗研究。注：刘红强和赵文影为同等贡献作者，张云静和逄文强为共同第一通信作者。郭玲花，刘红强，赵文影，等规模化猪场猪伪狂犬病和猪繁殖与呼吸综合征的诊断及防控效果评估J现代畜牧科技，2023，102（11）：1-6doi：10.19369/ki.2095-9737.2023.11.001GUO Linghua，LIU Hongqiang，ZHAO Wenying，et alDiagnosis and Control Effect Evaluation of Pseudorabies and Reproductive and Respiratory Syndrome on Large-scale Pig FarmsJModern Animal Husbandry Science&Technology，2023，102（11）：1-6规模化猪场猪伪狂犬病和猪繁殖与呼吸综合征的诊断及防控效果评估郭玲花1，2，刘红强2，赵文影1，2，孙哲1，2，卫璐璐1，2，谢莉敏1，2，田克恭1，2*，张云静1，2*，逄文强1，2*（1.国家兽用药品工程技术研究中心，河南 洛阳 471000；2.普莱柯生物工程股份有限公司，河南 洛阳 471000）摘要：为摸清某规模化养猪场猪群发病的原因。通过流行病学调查、病理剖检进行现场诊断，根据临床初步诊断对发病猪进行实验室检测，对阳性病料进行基因测序和分型鉴定；在临床诊断和实验室检测的基础上，进行临床方案制定及效果评估。结果表明，引起该场育肥猪发病的主要病原是猪伪狂犬病病毒（PRV），其次是猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）；分型鉴定和测序分析显示，该场感染的PRV毒株为变异株，PRRSV毒株为NADC30-like毒株，且成功分离1株PRV毒株。关键词：猪伪狂犬病；猪繁殖与呼吸综合征；诊断中图分类号：S858.28文献标识码：Adoi：10.19369/ki.2095-9737.2023.11.001Diagnosis and Control Effect Evaluation of Pseudorabies and Reproductive and Respiratory Syndrome on Large-scale Pig FarmsGUO Linghua1，2，LIU Hongqiang2，ZHAO Wenying1，2，SUN Zhe1，2，WEI Lulu1，2，XIE Limin1，2，TIAN Kegong1，2*，ZHANG Yunjing1，2*，PANG Wenqiang1，2*（1.National Research Center for Veterinary Medicine，Luoyang Henan 471000，China；2.Pulike Bioengineering Co.，Ltd，Luoyang Henan 471000，China）Abstract：In order to find out the cause of the disease in pigs on a large-scale pig farmEpidemiological investigation and pathological autopsy were carried out for on-site diagnosis，According to the preliminary clinical diagnosis，the infected pig were detected by laboratory testMeanwhile，The positive samples were identified by gene sequencing and typingOn the basis of clinical diagnosis and laboratory testing，the formulation of clinical protocols and effectiveness evaluation were carried outThe results showed that porcine pseudorabies virus（PRV）was the main pathogenic agent，followed by porcine reproductive and respiratory syndrome virus（PRRSV）Genotype identification and sequencing analysis showed that PRV strain was variant strain，PRRSV strain belonged to NADC30-like strain，and 1 PRV strain was successfully isolatedKeywords：porcine pseudorabies，porcine reproductive and respiratory syndrome，diagnosis2 2023.11试验研究征。PRV可感染多种哺乳动物，包括猪、野猪和反刍动物等2-3。最新研究表明，人类可能是PRV另一潜在宿主4-5。尽管PRV可感染多种动物，但是猪是唯一的天然宿主6。自2011年以来，国内许多猪场PR暴发，尽管这些猪场均已接种过Bartha-K61疫苗，但是受感染的新生仔猪死亡率仍高达50%以上7。众多学者研究表明，与传统毒株相比，新出现的PRV毒株表现出明显的遗传变异，且越来越多的证据表明，Bartha-K61疫苗不能完全保护仔猪免受变异株的侵袭8-10。猪繁殖与呼吸综合征是由猪繁殖与呼吸综合征病毒引起的一种高度接触性传染病，又称蓝耳病，临床上主要表现为妊娠母猪繁殖障碍和各年龄段猪的呼吸系统疾病11。自2006年以来，中国暴发高致病性蓝耳病12，随后NADC30-like株也相继在国内流行13，且极易发生重组14-15。猪蓝耳病病毒基因、抗原的多样性，给疫苗的防控带来更大的挑战。本文报道了某规模化养猪场发生的猪伪狂犬病变异株和猪繁殖与呼吸综合征NADC30-like毒株混合感染的案例，猪场通过采取有效的防控措施，使得疫情得到有效控制，减少了损失。1 流行病学调查2023年3月某规模化养猪场60日龄左右仔猪陆续发病，临床症状主要表现为咳嗽、精神沉郁、腹式呼吸、扎推等。猪群在0、86、110日龄时免疫猪伪狂犬病活疫苗，在20日龄免疫猪繁殖与呼吸综合征活疫苗，在35、65日龄时免疫猪瘟活疫苗（ST细胞源），发病猪均免疫过上述3种疫苗。综上，初步怀疑该猪场患有猪呼吸道疾病，实验室开展与猪呼吸道病原相关病毒分子生物学、抗体和病理检测。2 实验室检测 2.1 分子生物学检测取黄豆样大小的2头发病猪的肝脏、肺脏、脾脏、肾脏、扁桃体、淋巴结和脑组织样品，置于含有1 mL PBS的2 mL无菌EP管内，加入2粒钢珠，于组织破碎仪中进行组织研磨3 min，12 000 r/min离心3 min取上清液，利用Viral Nucleic Acid Extraction Kit 病毒核酸提取试剂盒进行核酸提取，分别使用PRRSV、PCV2、PCV3、PRV荧光定量检测方法进行核酸检测。结果显示，PRV和PRRSV阳性，见图1，说明该场猪可能感染了PRV和PRRSV。2.2 病理检测取2头猪肺脏、下颌淋巴结、肺门淋巴结和脑组织的病变交界处分别进行HE染色、PRRSV和PRV免疫组化试验。HE镜检可见，见图2（仅展示部分组织脏器检测结果）。肺脏、下颌淋巴结和肺门淋巴结出现小灶性坏死，肺泡腔少量浆液性渗出，脑组织未见明显病变。免疫组化镜检可见，见图3（2号猪组织脏器检测结果）、图4（1号猪组织脏器检测结果）。1号猪仅肺脏PRRSV弱阳性，2号猪的组织脏器除脑组织外均出现PRV阳性，且肺门淋巴结和下颌淋巴结均为PRV强阳性。以上结果表明猪场感染猪伪狂犬病病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒，且结合临床症状和分子生物学检测结果分析引起猪场发病的主要因素可能是猪伪狂犬病病毒。图1 PRRSV、PRV、PCV2和PCV3荧光定量检测结果“1-11-7”依次代表1号猪的肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、扁桃体、淋巴结、脑；“2-12-7”依次代表2号猪的肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、扁桃体、淋巴结、脑Amplification阳性对照阳性对照阳性对照阴性对照、抽提水、阴性对照、抽提水、阴性对照、抽提水、阴性对照、抽提水、2-22-1、2-32-71-11-5、1-7、2-1、2-2、2-42-71-11-7、2-12-71-11-7、2-12-71-11-71-62-3AmplificationAmplificationAmplification1086420141210864201210864201614121086420RFU（103）RFU（103）RFU（103）RFU（103）PRV FAM信号扩增曲线图谱PCV3 FAM信号扩增曲线图谱PCV2 FAM信号扩增曲线图谱PRRSV FAM信号扩增曲线图谱CyclesCyclesCyclesCycles00001010101020202020303030304040404032023.11试验研究图2 临床病料HE镜检结果A：肺脏；B：脑；C：下颌淋巴结；D：肺门淋巴结图3 2号猪组织脏器PRV免疫组化检测结果A：肺脏；B：下颌淋巴结；C：肺门淋巴结；D：脑；箭头所指代表阳性病变处图4 1号猪组织脏器PRRSV免疫组化检测结果A：肺脏；B：下颌淋巴结；C：肺门淋巴结；D：脑；箭头所指代表阳性病变处2.3 抗体检测分别采集30、40、50、60、70、110日龄仔猪的血清，使用荷兰Biochek公司PRV gB抗体检测试剂盒和美国IEDXX公司PRV gE抗体检测试剂盒进行抗体检测，结果见图5、图6。30日龄仔猪PRV gB和gE抗体阳性，40日龄仔猪群PRV gB抗体显著降低，说明30日龄仔猪群感染PRV，但是由于仔猪曾在出生后免疫过猪伪狂犬病活疫苗，因此在这个时间段感染病毒后，未引发明显的临床症状，随着仔猪日龄的增加，PRV gB抗体降低，而感染范围的扩大，导致大日龄仔猪开始表现出明显的临床症状。图5 不同日龄仔猪PRV gB抗体检测结果图6 不同日龄仔猪PRV gE抗体检测结果2.4 病毒基因分型鉴定和测序分析为鉴定猪场感染PRRSV和PRV的毒株类型，参照文献中所用检测方法16对PRRSV阳性病料进行基因分型鉴定，结果显示，PRRSV阳性样品扩增得到681 bp的目的条带，见图7，说明该场猪感染的PRRSV可能是类NADC30株或类NADC34株。参照文献16对PRRSV阳性病料核酸进行PRRSV ORF5基因、NSP2基因的扩增，并送生工生物工程（上海）股份有限公司测序。PRRSV ORF5基因和NSP2基因测序结果证实，该猪场感染的4 2023.11试验研究PRRSV毒株与NADC30-like株属于同一进化分支，且NSP2基因具有相同核苷酸位点的缺失，见图8、图9，说明该猪场感染了类NADC30-like毒株。图7 PRRSV阳性样品基因分型鉴定结果M：Marker；阳1：类NADC30-like阳性对照；阳2：高致病性PRRSV阳性对照；阳3：PRRSV经典株阳性对照；2-3：2号猪的肺脏对PRV阳性病料进行gB基因、gD基因、gE基因、gI基因、gC基因、gG基因和TK基因的扩增，并送生工生物工程（上海）股份有限公司测序。结果显示，猪场感染的PRV毒株与国内变异株处同一进化分支且同源性较高，说明该猪场感染了PRV变异株。图8 PRRSV ORF5基因遗传进化树“JSYC07-2023”：该场区PRRSV阳性测序样品标记图9 PRRSV NSP2基因核苷酸位点分析JSYC07-2023：该场区PRRSV阳性测序样品标记52023.11试验研究3 疾病诊断 根据抗体检测、核酸检测、病理和免疫组化检测等结果，最终确诊猪伪狂犬病病毒是引起猪场发病的主要因素。4 PRV病毒分离鉴定 称取2 g肺脏，用剪刀剪碎后加入10 mL DMEM培养基，经研磨处理后，6 000 r/min、4 离心10 min，取上清液经0.22 m滤器过滤除菌后，分装备用。将处理后的组织研磨液用含2%FBS的DMEM培养基2倍稀释，然后同步接种于PK-15细胞（200万/T25细胞瓶），同时设置正常细胞对照。培养7296 h收毒，或待细胞病变至80%时收毒，传至F3代，并进行荧光定量检测和病毒含量测定。图10结果显示，接毒后细胞产生CPE，且能够在细胞上稳定传代、增殖，病毒含量可达108.5TCID50/mL以上，将其命名为JSYC01-2023株。图10 细胞病变观察A：正常细胞；B：临床病料接种PK-15细胞病变5 PRV分离株中和抗体交叉保护试验 选取猪伪狂犬病灭活疫苗（HN1201-gE株）免疫后4周的4份血清样品，分别使用PRV HN1201株和JSYC01-2021株作为指示病毒，进行血清中和抗体效价测定。结果显示，猪伪狂犬病灭活疫苗（HN1201-gE株）免疫猪后产生的中和抗体对于HN1201株和JSYC01-2023株无差异，见表1，提示猪伪狂犬病灭活疫苗（HN1201-gE株）能够抵御PRV JSYC01-2023株的感染。表1 PRV分离株交叉保护试验验证结果猪号中和效价HN1201株JSYC01-2023株21#1355142724#1178121430#1398139833#18911266 防控措施6.1 加强管理6.1.1 生物安全管理猪场免疫活疫苗后，应注意散毒风险，及时消毒或销毁可能产生散毒风险的物品；对于免疫疫苗后猪群的粪便应做无害化处理。此外，全场应定期消毒，及时清理病死猪圈舍内粪污，保持圈舍通风干燥洁净。6.1.2 引种检测加强对引进猪群的检测工作，从根源杜绝野毒株感染。6.2 定期检测抗体针对猪伪狂犬病、猪圆环病毒病、猪繁殖与呼吸综合征、口蹄疫、非洲猪瘟等猪场常发疾病，定期开展抗体检测工作，做好疾病监测和免疫效果监测工作。通过监测抗体水平，调整猪场疫苗的免疫程序或及时更换疫苗，做到及时、科学、合理地防控。6.3 疫苗免疫选择针对变异株的猪伪狂犬病gE基因缺失灭活疫苗，健康猪紧急接种猪伪狂犬病灭活疫苗（HN1201-gE株）；同时为猪场策划变异株猪伪狂犬病毒的净化方案，猪场密集免疫猪伪狂犬灭活疫苗，减少已感染野毒猪排毒，阻止野毒在猪群中循环传播，降低野毒阳性率，猪场再根据实际情况采取检测+淘汰的方法，将gE抗体阳性猪淘汰。目前市场上尚未有针对PRRSV NADC30-like毒株的疫苗，可根据猪场PRRSV患病情况选择性使用猪繁殖与呼吸综合征疫苗。7 结论与讨论本试验通过流行病学调查、临床症状、剖检变化、核酸检测和病理检测等多方面检测手段，最终确诊引起该猪场疫病的病因主要是猪伪狂犬病，其次是猪蓝耳病。此外，通过基因分型鉴定，最终确定猪场感染的猪伪狂犬病是由变异株感染引起的，猪繁殖与呼吸综合征是由NADC3-like毒株感染引起的。近年，随着规模化、集约化养猪的持续发展，疾病更加复杂，多呈现混合感染，仅通过单一检测手段无法精准、及时地进行疾病的防控，给基层兽医人员临床诊断带来严峻挑战。因此在这种严峻的形势下，建议广大兽医人员在进行临床诊断的同时，应结合分子生物学检测技术、病理学检测等多方面检测手段准确判断致病原，减少误诊。确定引起猪场疫病的病原后，及时调整免疫程序或更换疫苗，尽可能减少疫病的损失。目前，市场上的猪繁殖与呼吸综合征疫苗主要针对经典株、高致病性毒株。对于猪繁殖与呼吸综合征6 2023.11试验研究编辑：方雅琪NADC30-like毒株引起的疾病尚无相应疫苗进行防控。尽量减少活疫苗的使用，有效避免毒株的变异。猪场对于疫病的诊断和防控，应根据实际情况进行具体分析，避免漏检、误检，导致误诊。参考文献1 Sun Y，Luo Y，Wang C H，et alControl of swine pseudorabies in China：Opportunities and limitationsJVet Microbiol，2016，183：119-1242 Cheng Z，Kong Z，Liu P，et alNatural infection of a variant pseudorabies virus leads to bovine death in ChinaJTransbound Emerg Dis，2020，67（2）：518-5223 Minamiguchi 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