基于嘧啶核心骨架的新型CDK2抑制剂的设计、合成及生物活性研究.pdf

申请代码 B020601 受理部门 收件日期 受理编号 国家自然科学基金 国家自然科学基金 申 请 书 申 请 书(2 0 1 1 版)(2 0 1 1 版)资助类别：青年科学基金项目 亚类说明：附注说明：项目名称：基于嘧啶核心骨架的新型 CDK2 抑制剂的设计、合成及生物活性研究 申 请 人：赵培亮 电话：02061648196 依托单位：南方医科大学 通讯地址：广州市沙太南路 1023 号南方医科大学药学院 邮政编码：510515 单位电话：02061648165 电子邮箱： 申报日期：2011年3月9日 国家自然科学基金委员会 国家自然科学基金申请书 2011 版 第 2 页 版本 1.018.463 基本信息基本信息 yEqGDFwv 姓名 赵赵培亮 性别男 出生 年月 1980 年 4 月 民 族 汉族 学位 博士 职称讲师 每年工作时间（月）10 电话 02061648196 电子邮箱 传真 020-61648197 国别或地区 中国 个 人 通 讯 地 址 广州市沙太南路 1023 号南方医科大学药学院 工作单位 南方医科大学/药学院 申 请 人 信 息 申 请 人 信 息 主 要 研 究 领 域 药物分子的设计、合成及性质研究 名称 南南方医科大学 联系人 赵镇 电子邮箱 依托单位信息 依托单位信息 电话 02061648165 网站地址 单 位 名 称 合作研究单位信息 合作研究单位信息 项目名称 基基于嘧啶核心骨架的新型 CDK2 抑制剂的设计、合成及生物活性研究 资助类别 青年科学基金项目 亚 类 说 明 附注说明 申请代码 B020601:药物分子设计与合成 基地类别 研究期限 2012 年 1 月 2014 年 12 月 研究属性 基础研究 项 目 基 本 信 息项 目 基 本 信 息 申请经费 27.0000 万元 摘 要(限 400 字)：摘 要(限 400 字)：细胞周期是细胞生命活动的基本特征。一个完整的细胞周期受多种蛋白酶的调控，调控失调会导致细胞过度增殖，从而引发肿瘤。以细胞周期蛋白依赖性激酶(cyclin-dependent kinases,CDKs)为靶点的药物可以阻断细胞周期，控制细胞增殖，从而达到抗肿瘤的目的。目前我们组已设计、合成了一批新型 CDK2 抑制剂，生物活性检测发现化合物 YWW-C 对肝癌细胞 HepG2 具有显著的抗肿瘤活性（IC50=9.4M）。本项目拟在现有工作的基础上，以其为先导化合物，对结构中的 A、B、C 三个关键部位进行进行结构改造和修饰，并进行活性测试。在此基础上，采用 CoMFA、CoMSIA 方法从分子的三维结构角度讨论化合物的立体性质、静电性质、疏水性质等与活性之间的关系，建立有较高预测能力的3D-QSAR 模型，为化合物结构的优化和修饰提供理论指导，以发展具有进一步修饰与开发潜力的高活性先导化合物。关 键 词关 键 词(用分号分开，最多 5 个)细胞周期蛋白依赖性激酶 2；嘧啶骨架；合成；抗肿瘤活性 国家自然科学基金申请书 2011 版 第 3 页 版本 1.018.463 项目组主要参与者项目组主要参与者（注:项目组主要参与者不包括项目申请人）编号 姓 名 出生年月 性别职 称 学 位 单位名称 电话 电子邮箱 项目分工 每年工作时间（月）1 周周中振 1979-10-06 男 讲师 博士 南方医科大学 02061648549 zzz_ 药物合成 5 2 王广发 1974-01-13 男 讲师 博士 南方医科大学 02061689415 生物活性测试5 3 伍伍小云 1979-10-29 女 讲师 博士 南方医科大学 02062789416 三维定量构效关系研究 5 4 段段安娜 1984-06-28 女 硕士生 学士 南方医科大学 02061648196 药物合成 10 5 陈玉嫔 1985-12-01 女 硕士生 学士 南方医科大学 02061648196 eping_ 药物合成 10 6 邓邓燕红 1986-03-09 女 硕士生 学士 南方医科大学 02061648196 药物合成 8 7 8 9 总人数 高级 中级 初级 博士后 博士生 硕士生 7 0 4 0 0 0 3 说明:高级、中级、初级、博士后、博士生、硕士生人员数由申请人负责填报（含申请人），总人数由各分项自动加和产生。国家自然科学基金申请书 2011 版 第 4 页 版本 1.018.463 经费申请表经费申请表 （金额单位：万元）科目 申请经费 备注（计算依据与说明）一.研究经费 一.研究经费 24.3000 1.科研业务费 8.4000 （1）测试/计算/分析费 4.3500化合物结构鉴定、生物活性测、工作站机时费、网络费（2）能源/动力费 1.3500实验室水电费，按 5%计算（3）会议费/差旅费 1.5000国内学术会议（4）出版物/文献/信息传播费 1.2000论文发表、专利申请、成果查新、学术刊物查阅、专家咨询等费用（5）其他 2.实验材料费 13.9000 （1）原材料/试剂/药品购置费 12.7000购置各种化学试剂、原料、溶剂、对照品，酶等（2）其他 1.2000易破损玻璃仪器及加工等费用 3.仪器设备费 2.0000 （1）购置 2.0000磁力搅拌器、微量移液器等（2）试制 4.实验室改装费 5.协作费 二.国际合作与交流费 二.国际合作与交流费 0.0000 1.项目组成员出国合作交流 2.境外专家来华合作交流 三.劳务费 三.劳务费 1.3500直接参加本研究的研究生的劳务费 四.管理费 四.管理费 1.3500按基金委规定提取 合 计 合 计 27.0000 国家其他计划资助经费 其他经费资助（含部门匹配）与本项目相关的 其他经费来源 其他经费来源合计 其他经费来源合计 0.0000 国家自然科学基金申请书 2011 版 第 5 页 申请者在撰写报告正文时，请遵照以下要求：1、请先选定项目基本信息中的资助类别，再填写报告正文；2、在撰写过程中，不得删除系统已生成的撰写提纲（如误删可点击“查看报告正文撰写提纲”按钮，通过复制/粘贴恢复）；3、请将每部分内容填写在提纲下留出的空白区域处；4、本要求将作为申请书正文撰写是否规范的评判依据，请遵照要求填写。报告正文 报告正文青年科学基金项目申请书撰写提纲 青年科学基金项目申请书撰写提纲 （一）立项依据与研究内容（一）立项依据与研究内容（4000-8000 字）：1.1.项目的立项依据项目的立项依据（研究意义、国内外研究现状及发展动态分析，需结合科学研究发展趋势来论述科学意义；或结合国民经济和社会发展中迫切需要解决的关键科技问题来论述其应用前景。附主要参考文献目录）肿瘤的发生与多种癌基因和抑癌基因的失衡有关。生物进化过程中，细胞建立了一系列的调控机制，以确保细胞周期各时相严格有序地进行。不受控制的细胞增殖是恶性肿瘤的最重要特征1-3；多数恶性肿瘤的发生、发展均与细胞周期调控功能紊乱有关，因此，调节或阻断细胞周期是治疗肿瘤的重要途径4-6。2001 年，美国科学家利兰哈特韦尔、英国科学家保罗纳斯和蒂莫西亨特，因发现细胞周期蛋白依赖性激酶(cyclin-dependent-kinases,CDKs)及其在细胞周期调控中的作用，获得了当年度的诺贝尔生理学或医学奖。细胞周期的运行与否，能否按序完成众多细胞周期事件，均受控于精密的细胞周期调控机制7。细胞周期循环可以分为 4个不同的阶段：第 1阶段（G1）是准备用于 DNA复制的细胞；第 2阶段（S）是整个基因组的细胞被复制；第 3阶段（G2）细胞开始准备分裂；第 4阶段（M）是有丝分裂的阶段，DNA的两个复制体开始分离，两个起源相同的子细胞产生。CDK2是细胞周期蛋白依赖性激酶(CDKs)的一种，它对控制细胞分裂有关键作用，与周期蛋白 E1结合使底物磷酸化，控制 G1 时期的进行，由于正常细胞通常在 G0G1 时期之间休眠，要缓解肿瘤细胞对正常细胞的威胁，在 G1 阶 国家自然科学基金申请书 2011 版 第 6 页 段抑制肿瘤细胞生长要比在细胞周期的其它阶段的程度大，因此，近几年来，CDK2 已经成为基于 CDKs 抗肿瘤药物设计中最吸引人的一个靶标 8-12。目前,已有一些 CDK2 抑制剂被报道,其结构主要集中在：嘧啶类、嘌呤类、吡唑类、异喹啉类、吲哚类、吡咯并咔唑类等（Sheme 1）。它们通过与 ATP(三磷酸腺苷)竞争结合激酶的 ATP结合位点，从而阻止激酶将 ATP的-磷酸转移到酶的底物（pRb），最终达到抑制底物磷酸化的目的。但由于激酶 ATP 位点的保守性,其中大多缺乏较好的选择性,所以选择性一直是激酶抑制剂研究中的重要难题和研究热点13-16。虽然 CDKs 抑制剂结构繁多，但它们的骨架结构都是疏水性的含氮杂环或接近共平面的含氮稠杂环。NNNNNHPhNNNONHNHNNHNONSN2 NU60271.3 MM50.12 MM677nMNNH2NNH2ONOCDKs inhibitorIC50(for CDK2)NNH2N10.03MMNHNONNNNHH2N3 H7170.05MM40.097 MMNNHNNNHNO Scheme 1 细胞周期蛋白依赖性激酶（CDK2）抑制剂 近年来，CDKs 抑制剂的研究虽然取得了令人瞩目的成就，人们对 CDKs 在细胞周期中的调控分子机制的认识也更为深刻，但仍有许多关键问题尚未解决，如对但仍有许多关键问题尚未解决，如对 CDKs 的研究仍不够充分，迄今尚无单一的研究仍不够充分，迄今尚无单一 CDKs 特异性抑制剂出现，目前已有的特异性抑制剂出现，目前已有的 CDKs 小分子抑制剂主要通过阻断小分子抑制剂主要通过阻断 CDK 的的 ATP 结合位点来抑制其激酶功能，但由于结合位点来抑制其激酶功能，但由于 ATP 结合位点存在的广泛性，使其作用的特异性较差，副作用极为明显，限制了其临床应用，因此非常有必要进一步深入研究。结合位点存在的广泛性，使其作用的特异性较差，副作用极为明显，限制了其临床应用，因此非常有必要进一步深入研究。同时最近有临床试验研究发现，特异性药理学 CDK2 抑制剂在抗癌及抗病毒过程中几乎没有任何负作用，至今也没有出现抗药理性 CDK2 抑制剂病毒变异体17。高选择性 CDK2 小分子抑制剂不但能提高肿瘤的治疗潜力，还可作为探索疾病发生发展过程的有力工具，因此，CDK2 选择性激酶抑制剂的研发已经成为当前抗肿 国家自然科学基金申请书 2011 版 第 7 页 瘤药物研究的热点领域18-19。在前期工作中，我们课题组在文献调研的基础上发现，2-杂环氨基-4-芳氨基取代嘧啶类化合物通常具有较高的 CDK2 抑制活性，可在 G1期抑制视网膜细胞瘤蛋白(retinoblastoma protein,pRb)磷酸化，从而在 pRb(+)细胞中阻断细胞周期，而且嘧啶类抑制剂结构简单、抑制活性较高，因而倍受人们青睐。因此，我们组针对具有优良 CDK2激酶抑制活性的嘧啶类化合物，采用比较分子力场分析方法(CoMFA)建立了 3D-QSAR模型，同时采用分子对接方法系统研究了嘧啶类化合物与已知晶体结构的 CDK2 激酶的作用模式。根据上述两个模型发现了打分较高的一类化合物，并进行了合成。结构通式如 Scheme 2所示(骨架结构可分为 A、B、C三部分)。Scheme 2 课题组前期设计、合成的 CDK2 抑制剂的结构通式 生物活性测试发现，部分化合物表现出了较高的肿瘤抑制活性，值得关注的是，化合物生物活性测试发现，部分化合物表现出了较高的肿瘤抑制活性，值得关注的是，化合物 YWW-C 对肝癌细胞对肝癌细胞 HepG2 具有显著的抗肿瘤活性（具有显著的抗肿瘤活性（IC50=9.4M），显示出良好的结构修饰前景，有关结果已提交申请中国发明专利。），显示出良好的结构修饰前景，有关结果已提交申请中国发明专利。同时 YWW-C 与 CDK2 激酶的分子对接研究表明，嘧啶环中的 1-位氮原子作为氢键受体与活性口袋中的亮氨酸残基Leu83侧链中的氨基上的氢原子形成一个氢键，同时 2-位仲氨上的氢原子作为氢键供体与活性口袋中的谷氨酸残基 Glu81侧链中的羰基上的氧原子形成另外一个氢键。此外嘧啶环 4-位的苯环（A环）插入疏水袋区，与 CDK2 骨架上的 Tle10形成较强疏水作用力。基于上述背景，为了阐明嘧啶类 CDK2 抑制剂的构效关系，获得更高活性的 CDK2抑制剂，本项目拟在现有工作的基础上，以化合物 YWW-C为先导结构，结合前期分子对接的研究结果，在保留先导物与靶点蛋白结合位点形成氢键基团的基础上，增加与CDK2 的 ATP活性口袋的可能的结合位点，并根据生物电子等排原理、活性亚结构拼接方法，分别对化合物中的 A、B、C 部位进行结构修饰和改造，对其进行活性测试，并 国家自然科学基金申请书 2011 版 第 8 页 根据实验所获得的 IC50 值，采用比较分子场分析法（CoMFA）和比较分子相似性指数分析法（CoMSIA）系统研究所设计并合成的目标化合物的三维定量构效关系，探讨取代基的立体效应和静电效应对其抗肿瘤活性的影响，为 CDK2 抑制剂的研究提供理论依据。本研究的实施将有利于进一步明确嘧啶类 CDK2 抑制剂的构效关系，并为其结构优化提供理论指导，有望发现新型的具有潜在药用前景的抗肿瘤药物。主要参考文献 主要参考文献 1.Harper,J.W.;Adams,P.D.Cyclin-dependent kinases.Chem.Rev.2001,101(8),2511-2526.2.Pinhero,R.;Liaw,P.;Bertens,K.;Yankulov,K.Three cyclin-dependent kinases preferentially phosphorylate different parts of the C-terminal domain of the large subunit of RNA polymerase II.Eur.J.Biochem.2004,271(5),1004-1014.3.李文赟，张磊，李福龙，王朝晖，姚其正.抗肿瘤细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂的研究进展.国外医药抗生素分册，2009,30(3),113-120.4.Saiz,J.E.;Fisher,R.P.A.CDK-activating kinase network is required in cell cycle control and transcription in fission yeast.Curr Biol.2002,12(13),1100-1103.5.Dissmeyer,N.;Weimer,A.K.;Pusch,S.;De-Schutter,K.;Kamei,C.L.;Nowack,M.K.;Novak,B.;Duan,G.L.;Zhu,Y.G.;De-Veylder,L.;Schnittger,A.Control of Cell Proliferation,Organ Growth,and DNA Damage Response Operate Independently of Dephosphorylation of the Arabidopsis Cdk1 Homolog CDKA.Plant Cell,2009,21(11),3641-3654.6.Fischer,P.M.Recent advances and new directions in the discovery and development of cyclin-dependent kinase inhibitors.Durr.Opin.Drug Discov.Dev.2001,4(5),623-634.7.Sielecki,T.M.;Boylan,J.F.;Benfield,P.A.;Trainor,G.L.Cyclin-dependent kinase inhibitors:Useful targets in cell cycle regulation J.Med.Chem.2000,43(1),1-18.8.梁彬,邹向阳.细胞周期蛋白依赖性激酶及抑制因子与肿瘤.中国实验诊断学,2006(11),1378-1380.国家自然科学基金申请书 2011 版 第 9 页 9.Shapiro,G.I.Cyclin-dependent kinase pathways as targets for cancer treatment,J.Clin.Oncol.2006,24(11),1770-1783.10.Malumbres,M.;Barbacid,M.Mammalian cyclin-dependent kinases,Trends Biochem.Sci.2005,30(11),630-641.11.Whittaker,S.R.;Poele,R.H.T.;Chan,F.;Linardopoulos,S.;Walton,M.I.;Garrett,M.D.;Workman,P.The cyclin-dependent kinase inhibitor seliciclib(Rroscovitine;CYC202)decreases the expression of mitotic control genes and prevents entry into mitosis.Cell Cycle,2007,6(24),3114-3131.12.Malumbres,M.;Pevarello,P.;Barbacid,M.;Bischoff,J.R.CDK inhibitors in cancer therapy:what is next?,Trends Pharmacol.Sci.2008,29(1),16-21.13.Johnson,N;Bentley,J;Wang,L.;Newell,Z.D.R.;Robson,C.N.;Shapiro,G.I.;Curtin,N.J.Pre-clinical evaluation of cyclin-dependent kinase 2 and 1 inhibition in anti-estrogen-sensitive and resistant breast cancer cells.Br.J.Cancer,2010,102(2),342-350.14.Diaz-Padilla,I.;Siu,L.L.;Duran,I.Cyclin-dependent kinase inhibitors as potential targeted anticancer agents.Invest New Drugs,2009,27(6),586-594.15.Fisher,R.P.Coming full circle:cyclin-dependent kinases as anti-cancer drug targets.Subcell Biochem.2010,50,1-15.16.Schang,L.M.Advances on cyclin-dependent kinase(CDK)as novel targets for antivival drugs.Curr.Drug Target Infects Disord,2005,5(1),29-37.17.Hirai,H.;Kawanishi,N.;Iwasawa,Y.Recent advanog in the development of selective small molecule inhibitors for cyclin-dependent kinases.Curr.Top Med.Chem.2005,5(2),167-179.18.Elgazwy,A.S.S.H.;Ismail,N.S.M;Elzahabi,H.S.A.A convenient synthesis and molecular modeling study of novel purine and pyrimidine derivatives as CDK2/cyclin A3 inhibitors.Bioorg.&Med.Chem.2010,18(21),7639-7650.19.Toumi,M.;Barbazanges,M.;Kroll,S.H.B.;Patel,H.;Ali,S.;Coombes,R.C.;Barrett,A.国家自然科学基金申请书 2011 版 第 10 页 G.M.Concise,flexible syntheses of 4-(4-imidazolyl)pyrimidine cyclin-dependent kinase 2(CDK2)inhibitors.Tetrahed.Lett.2010,51(47),6126-6128.2.项目的研究内容、研究目标,以及拟解决的关键科学问题。项目的研究内容、研究目标,以及拟解决的关键科学问题。（此部分为重点阐述内容）2.1 研究内容研究内容 本研究将以前期工作中筛选出的具有全新结构的高活性化合物YWW-C为先导，综合运用有机合成、生物技术和计算机辅助药物设计的理论，分别对其A、B、C结构单元进行改造和修饰，并测试目标化合物的抗肿瘤活性以及酶抑制活性，以获取其构效关系，发展具有开发潜力的新型CDK2抑制剂。（1）目标化合物的设计与合成目标化合物的设计与合成 A环的结构修饰环的结构修饰 在保留先导物与靶点蛋白结合位点形成氢键基团的基础上，即保持B、C环骨架结构不变的前提下，根据生物电子等排原理，将A环替换为吡啶或嘧啶环。并在吡啶或嘧啶环的相应位置上引入吸电子的F、Cl、Br，供电子的-CH3、CH3O-以及体积较大的C6H5CH2O-等基团。NNNHNHNSCH3OOO2NNNNHNHNXYSCH3OOnO2NRX=N,Y=CX=N,Y=Nn=0,1AScheme 3H3COYWW-C B环的结构修饰环的结构修饰:根据我们多年的药物设计经验，拟在保留核心骨架结构基础上，基于分子内环化的设计策略，将杂环B环修饰为结构新颖的嘧啶并哌嗪环、嘧啶并吗啉环，这种母核保留了与关键氨基酸残基亮氨酸Leu83上的氨基形成氢键相互作用所需要的嘧啶环1-位的氮原子。国家自然科学基金申请书 2011 版 第 11 页 Scheme 4NNXNHNNSO2MeOn=0,1X=O,NHnRNNNHNHNSCH3OOO2NBYWW-CH3CO C环的结构修饰环的结构修饰:在保持A、B环骨架结构不变的前提下，即保留先导物与靶点蛋白结合位点形成氢键基团的基础上，根据生物电子等排原理，将C环由哌啶替换为吡咯或苯环。并将哌啶1-位的甲磺酰基替换为-CH3、COCH3-、-CO2CH3、-SO3H、-SO3NH2等基团。NNNHNHNRR2nn=0,1R=H,CH3,COCH3NNNHNHRR2R=H,CH3,COCH3,CO2CH3SO3H,SO3NH2,SO3CH3H3COH3COYWW-CNNNHNHNSCH3OOO2NCScheme 5H3CO(2)生物活性测试生物活性测试 分别检测目标化合物的体内抗肿瘤活性和体外抗肿瘤活性。体外抗肿瘤活性选择对肝癌（HEPG2）、肺癌（A549）、胃癌（SGC7901）、乳腺癌（MCF-7）和结肠癌（LoVo）进行体外抑制活性检测，并获得相应的IC50 值。体内抗肿瘤活性选择对裸鼠体内接种LoVo结肠癌细胞的抑制活性，并获得相应的IC50 值。此外，本项目还将采用ELISA试剂盒筛选目标化合物对CDK2的酶抑制活性。国家自然科学基金申请书 2011 版 第 12 页 (3)三维定量构效关系（三维定量构效关系（3D-QSAR）研究）研究 根据实验所得的活性数据，采用CoMFA、CoMSIA方法建立具有较高预测能力的嘧啶类含氮杂环衍生物的3D-QSAR模型，从分子的三维结构角度讨论化合物的立体性质、静电性质、疏水性质等与活性之间的关系，初步研究嘧啶类含氮杂环衍生的构效关系。2.2 研究目标：研究目标：本项目拟在现有工作的基础上，根据我们前期所设计并合成的化合物的化学结构特点与抗肿瘤活性特点，以YWW-C为先导化合物，综合运用计算机辅助分子设计、有机合成、生物学评价等方法，对化合物进行结构改造和修饰，完成40 60 个所设计目标化合物的合成、结构表征和生物活性测试；并总结与研究该类化合物的结构活性关系，对结构变化对生物活性的影响作出合理的解释，将过去定性的研究结论，通过建模设计合成活性测试设计的循环，达到定量的水平，并在此基础上力争获得1 2个具有良好修饰与开发潜力、结构新颖的抗肿瘤药物先导结构，并申请专利，发表较高水平论文，为新型抗肿瘤药物的创制奠定一定的理论基础。2.3 拟解决的关键问题：拟解决的关键问题：探索系列嘧啶类稠杂环化合物的合成方法，构建结构衍生化潜力大的嘧啶类化合物库，是课题合成目标化合物的关键。在课题进展中，及时探讨新型CDK2抑制剂的构效关系，并运用于设计合成更高活性的基于嘧啶骨架的CDK2抑制剂，是课题顺利开展并获得预期效果的关键之二。3.拟采取的研究方案及可行性分析。拟采取的研究方案及可行性分析。（包括有关方法、技术路线、实验手段、关键技术等说明）3.1 研究方案研究方案 在本项目实施中，主要采取基于先导化合物（YWW-C）结构的分子设计（生物等排原理、活性亚结构拼接方法）结构修饰生物活性测试计算机辅助分子设计（如3D-QSAR方法）合成生物活性测试高活性先导化合物的思路进行研究，并综合运用计算机辅助分子设计、有机合成技术及生物技术进行多学科的交叉和协作，探索发现结构新颖的抗肿瘤先导化合物。具体研究方案见流程图1所示：国家自然科学基金申请书 2011 版 第 13 页 3.2 技术路线和实验手段技术路线和实验手段（1）目标化合物的合成）目标化合物的合成 A环结构修饰目标化合物的合成环结构修饰目标化合物的合成:以2,4-二氯-5-硝基嘧啶为起始原料，在三乙胺做缚酸剂的条件下，与各种取代氨基嘧啶或氨基吡啶进行亲核取代反应，在-15的低温下可以选择性的生成4-位取代的嘧啶衍生物，然后在室温下与1-（甲磺酰基）哌啶-4-氨进行取代反应得到目标化合物。NNO2NClClaNNO2NClScheme 6.(a)Et3N,THF,-15;(b)1-(methylsulfonyl)piperidin-4-amine,Et3N,THF,r.t.NNNHNHNXYSCH3OOnO2NR+NH2XYnRNHXYnR+NNO2NNHClYXnRmajorb 国家自然科学基金申请书 2011 版 第 14 页 B环结构修饰目标化合物的合成环结构修饰目标化合物的合成:由起始原料与-氨基乙酸乙酯或-羟基乙酸乙酯进行亲核取代反应，在B环上引入酯基，然后将该酯基邻位的硝基用H2，Pd/C还原为氨基，再在温和条件下使该氨基与邻近的酯基发生胺解反应，形成环状内酰胺结构，即可得到B环并哌嗪环、B环并吗啉环骨架结构。NNO2NClClabNNO2NClXOd or ecScheme 7.(a)ethyl 2-aminoacetate,or ethyl 2-hydroxyacetate,Et3N,THF,-10;(b)1-(methylsulfonyl)piperidin-4-amine,Et3N,THF,r.t.;(c)Zn,THF,10%HCl;(d)substituted benzyl bromide,K2CO3,DMF;(e)substitutedfluorobenzene,Pd(OAc)2,BINAP,t-BuOK,80.ONNO2NNHXOONSO2MeNNXNHNHNSO2MeONNXNHNNSO2MeOn=0,1X=O,NHnR C环结构修饰目标化合物的合成环结构修饰目标化合物的合成:以2,4-二氯-5-硝基嘧啶为起始原料，在三乙胺做缚酸剂的条件下，与对甲氧基苯胺进行亲核取代反应，在-15的低温下可以选择性的生成4-位取代的嘧啶衍生物，然后在室温下分别与各种取代哌啶-4-氨、取代吡咯烷-3-氨、取代苯胺反应得到目标化合物。NNO2NClClaNNO2NClScheme 8.(a)Et3N,THF,-15;(b)Et3N,THF,r.t.H2NN R+NH+NNO2NNHClmajorbnbH2NRNH2H3COOCH3H3CONNO2NNHNH+majorH3COn=0,1R=H,CH3,COCH3R=H,CH3,COCH3,CO2CH3SO3H,SO3NH2,SO3CH3NRnNNO2NNHNHH3COR 国家自然科学基金申请书 2011 版 第 15 页 3.3 抗肿瘤活性测试抗肿瘤活性测试 基于细胞水平的活性测试基于细胞水平的活性测试:药物处理：将对照药品和目标化合物分别用 0.01 mol/L PBS溶解配成原药贮存液 l mg/mL，20保存。CCK-8 法测抑制率：取对数生长期的肿瘤细胞，配制 1 104 cells/L 起始浓度细胞，每孔加 100L到 96 孔培养板内(Corning,美国)，每组 5 孔，接种 24 h 后弃去上清，加药物浓度分别为 0,1,2,4,8,16,32g/mL 的目标化合物，并设对照组和空白组，培养 4 h，再各补加无双抗含 10%胎牛血清的 RPMI-1640 培养液 100L，72 h 后每孔加入 10L 的CCK8 试剂（Dojindo，日本），然后继续培养 2 h，在 450 nm 波长处测定吸光度 A，参考波长为 655 nm，并按下列公式计算抑制率：抑制率=1-(A 实验孔-A 空白孔)/(A 对照孔-A 空白孔)100%基于动物体内的活性测试基于动物体内的活性测试:实验方法：常规复苏人结肠癌细胞株 Colo205，用含 10%新鲜小牛血清的 DMEM 培养基，37、5%CO2培养，至对数生长期后收集细胞，用预热至 37的生理盐水调整细胞数至 1107/ml，立即接种至 32 只准备好的 68 周龄的 BALB/c裸鼠左腋皮下，每只小鼠皮下注射 0.2 ml(约 2.0106细胞/只)。继续饲养 15天至皮下可见明显的肿瘤块形成，用游标尺测量肿瘤体积长径和短径，计算肿瘤体积为给药前肿瘤体积。按肿瘤体积大小随机分为模型组、高(20mg/kg)、中(10mg/kg)、低剂量组(5mg/kg)，每组 8 只,雌雄各半。并按剂量灌胃给药，连续 12天。分别在给药后第 4、7、12天测量肿瘤长径和短径，计算瘤体积和抑瘤率。肿瘤体积=/6(长径短径 2)。肿瘤抑瘤率=(模型组平均体积-给药组平均体积)/模型组平均体积100%。基于 CDK2 的酶活性测试基于 CDK2 的酶活性测试:目标化合物对 CDK2 的抑制活性可以使用酶联免疫法（ELISA）的试剂盒(catalog no.7519,Cell Signaling Technology,USA)测试，具体操作方法如下：取 100L 10mM ATP加至 1.25mL 6M 底物肽中，用 dH2O(l.15mL)将上述混合物稀释至 2.5mL，从而配得 2ATp/Substrate Cocktail(ATP=400M，Substrate=3M)。然后取 1mL 10Kinase Buffer 1mL 10Kinase Buffer:250 mM Tris-HCl pH=7.5;100 mM MgC12;lmM Na3VO4，国家自然科学基金申请书 2011 版 第 16 页 50mM b-glyceroPhosPhate;20 mM dithiothreitol(DTT)加到 1.5mL dH20中，配得 2.5mL 4reaction buffer.将 CDK2/CycE Kinase 从80 冰箱中转移到冰上，冰浴中自然解冻。4下迅速离心将液体离心至瓶底后立即转移到冰浴中。取 2.5mL 4reaction buffer 稀释酶，配得 4Reaction Cocktail(enzyme=4.o ng/l in 4Reaction Cocktail)。每孔加入12.5L 待测化合物(通常化合物浓度设在 10M 左右)，然后加 12.5L 4Reaction Cocktail，即得 25LReaction Cocktail/Compound，室温下孵育 5min。然后每孔中再加25L of 2ATP/substrate cocktail，此反应板室温下孵育 30min。每孔加入 50L反应终止反应。链霉亲和素包被的 96孔板中每孔加入 75L dH2O后，将上述反应液每孔转移出 25L此 96孔板中，室温下孵育 60min。倒去孔中液体，每孔加入 200L PBS/T，洗涤三次。用含 l%BSA的 pBS/T 将一抗(phosphor-Rb(Ser780)Antibody)以 l:1000的比例稀释。每孔中加入 100L，室温下孵育 120min。HRP 标记的二抗(anti-rabbit IgG)用含l%BSA的pBS/T以l:1000稀释，每孔加入100L上述抗兔IgG溶液，室温下孵育 30min。每孔加入 100L的 TMB底物显色剂，室温反应 15min。每孔加入 100L的终止液，混合均匀后，酶标仪在 450nm测定吸收值，计算 IC50值。3.4 三维定量构效关系研究3.4 三维定量构效关系研究 根据实验所获得的 IC50 值，建立所设计合成的目标化合物的交叉验证（CoMFA方法和 CoMSIA方法）模型，研究该系列化合物的三维定量构效关系。3.5 可行性分析可行性分析 本项目是在结合项目负责人的专业特点和研究背景、已有的或即将投入使用的 研究手段、充分的前期工作基础上提出来的。每一个研究步骤都是根据文献已报道的方 法和结合项目负责人前期的工作基础精心推敲出来的，方法具体可行。申请人一直从事药物分子设计、合成及其性质研究的科研工作，在（1）抗肿瘤 药物研究；（2）药物分子设计、合成方法学等方面做了大量的研究工作，迄今已在J.Am.Chem.Soc.、Adv.Synth.Catal.、J.Agric Food Chem、Bioorg.Med.Chem 以及有机化学等国内外学术期刊上表了多篇SCI 论文。多名硕士研究生的参加为研究工作的开展提供了人员保障。另外，本研究项目 所需要的分析测试条件和活性测试条件基本具备（参见“（二）工作基础与工作条件”）。国家自然科学基金申请书 2011 版 第 17 页 因此，在三年内完成上述课题是可能的。项目组成员包含有机化学博士2 名（负责药物分子设计与合成），药学博士1 名（负责药物活性测试），应用化学博士1 名（负责构效关系研究），硕士生三名（负责药物合成）。成员分布涵盖药物合成、生物活性测试和理论计算三大方向，为课题的顺利开展提供保证。因此，上述采用的设计方案、技术路线成熟可行，研究人员分布合理，工作时间稳 定，完全可以保证项目的顺利实施。4.本项目的特色与创新之处。4.本项目的特色与创新之处。（1）本项目所选先导化合物）本项目所选先导化合物 YWW-C 是一未见文献报道的全新结构的化合物。是一未见文献报道的全新结构的化合物。以前期工作筛选出的活性化合物 YWW-C 为先导物，深入解析 CDK2 蛋白与配体的结合模型，在保留先导物与靶点蛋白结合位点形成氢键基团的基础上，增加与 CDK2 的 ATP活性口袋的可能的结合位点，并结合生物电子等排原理、活性亚结构拼接方法，分别对化合物中的 A、B、C部位进行结构修饰，以期进一步提高其生物活性。（2）综合运用计算机辅助分子设计、有机合成技术及生物技术进行多学科的交叉和协作，探索发现结构新颖的抗肿瘤先导化合物。综合运用计算机辅助分子设计、有机合成技术及生物技术进行多学科的交叉和协作，探索发现结构新颖的抗肿瘤先导化合物。本项目根据实验所获得的 IC50 值，采用比较分子场分析法（CoMFA）和分子相似性指数分析法（CoMS