复旦学报（医学版）FudanUnivJMedSci2023May，50（3）m6A-SAC-seq在单核苷酸分辨率水平检测RNAm6A修饰孟瀚哲1，2何维志2胡璐璐1，2△（1复旦大学生物医学研究院上海200032；2复旦大学肿瘤研究所上海200032）【摘要】目的建立m6A特异性烯丙基标记测序（m6A-selectiveallylchemicallabelingandsequencing，m6A-SAC-seq）实验方法体系，在单核苷酸分辨率水平对RNA的N6-甲基腺苷（m6A）修饰进行检测。方法m6A烯丙基标记测序（m6A-SAC-seq）使用特异性甲基转移酶MjDim1对m6A添加烯丙基标记成为N6-烯丙基-甲基腺苷（am6A），使用I2处理产生N1，N6-环化腺苷（A）产物，在逆转录时引入突变，从而实现在单核苷酸分辨率水平的检测。通过HPLC法纯化甲基转移酶MjDim1，使用探针及液相色谱-质谱联用系统（LC-MS/MS）检测m6A的转换率，计算MjDim1活性作为质控。提取样品RNA，用烯丙基标记m6A，并用m6A-SAC-seq技术构建文库，测序后通过数据分析得到m6A位点信息，通过标准曲线校准计算得到m6A的含量。结果m6A-SAC-seq处理后，HIV逆转录酶识别环化的am6A位点，引入突变，但附近未修饰位点不发生突变。通过特定的A突变成T/C的突变位置（AtoT/C）来识别m6A位点，并添加内参探针，用标准曲线来定量m6A含量。结论m6A-SAC-seq技术仅需30ng的mRNA或去除了rRNA的总RNA样本就可以实现m6A位点在单核苷酸分辨率水平的检测。【关键词】RNA甲基化；m6A甲基化；单核苷酸分辨率；m6A-SAC-seq；测序方法【中图分类号】Q3-3【文献标志码】Adoi：10.3969/j.issn.1672-8467.2023.03.017m6A-SAC-seqmethoddetectingRNAm6AmodificationatsinglenucleotideresolutionlevelMENGHan-zhe1，2，HEWei-zhi2，HULu-lu1，2△（1InstitutesofBiomedicalSciences，FudanUniversity，Shanghai200032，China.；2FudanUniversityShanghaiCancerInstitute，Shanghai200032，China）【Abstract】ObjectiveToestablishastep-by-stepprotocolofm6A-selectiveallylchemicallabelingandsequencing（m6A-SAC-seq）fordetectionofN6-methyladenosine（m6A）modificationsofRNAatsinglenucleotideresolutionlevel.Methodsm6A-SAC-sequsedspecificmethyltransferaseMjDim1toaddallylgrouptom6A，generatingam6A.ThenI2wasaddedtoproduceN1，N6-cyclizedadenine（A）products.Mutationswereintroducedduringreversetranscriptiontoachievesingle-nucleotideresolutiondetection.MethyltransferaseMjDim1waspurifi...
