2015-04-23发布2015-05-01实施DBS13河北省地方标准DBS13/003—2015食品安全地方标准阪崎肠杆菌和沙门氏菌检测河北省卫生和计划生育委员会发布DBS13/003—2015I前言本标准按GB/T1.1-2009规定的格式编写。本标准由河北省卫生和计划生育委员会归口。本标准于2015年4月23日首次发布。DBS13/003—20151食品安全地方标准阪崎肠杆菌和沙门氏菌检测1范围本标准适用于应用实时荧光定量PCR法定性检测阪崎肠杆菌和沙门氏菌。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB4789.4食品安全国家标准食品微生物学检验沙门氏菌检验。GB4789.40食品安全国家标准食品微生物学检验阪崎肠杆菌检验。3方法提要阪崎肠杆菌和沙门氏菌均属于肠杆菌科，本检测方法首先对肠杆菌科和阪崎肠杆菌进行同步检测。当肠杆菌科为阴性时可直接报告沙门氏菌阴性；当肠杆菌科为阳性时再进行沙门氏菌的检测；当阪崎肠杆菌为阳性时需按照GB4789.40进行确证；当沙门氏菌为阳性时需按照GB4789.4进行确证。4设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：4.1二级生物安全柜4.2磁力搅拌器：0-2400r/min。4.3卤素灯：500W。4.4低温离心管架：1.5mL，0℃。4.5水浴锅或金属恒温加热器：5℃-100℃。4.6漩涡振荡器。4.7离心机：12000r/min。4.8移液器及对应吸头：10μL、100μL、200μL、1000μL。4.9超净工作台。4.10实时荧光定量PCR仪（含有FAM-,HEX-和ROX-检测通道）。4.11冰箱：2℃—8℃和-20℃两种。DBS13/003—201524.12天平：感量0.1g。4.130.2mL8联排管以及8联排帽（与PCR仪配套使用）。4.141.5mL无菌透明离心管。4.15恒温培养箱：25℃±1℃，36℃±1℃，44℃±0.5℃。4.16无菌锥形瓶：容量100mL、200mL、2000mL。5培养基和试剂除有特殊说明外，所有实验用试剂均为分析纯。5.1缓冲蛋白胨水（BPW）：见附录A.1。5.2营养肉汤培养基（NB）：见附录A.2。5.3125µg/mL溴化乙锭单叠氮溴溶液（EMA）：见附录A.3。5.4DNA提取缓冲液:0.1%Chelex100（螯合树脂）水溶液。5.5吐温80。5.6按照表1和表4的序列合成的引物和标记的探针。5.7TaqDNA聚合酶：5U/µL。5.8TaqPCR缓冲液。5.950mmol/LMgCl2溶液：见附录A.4。5.10dNTPs（dATP,dUTP,dCTP,dGTP），浓度均为10mmol/L。5.11尿嘧啶-N-糖基化酶：1U/µL。5.12pUC19质粒DNA，200拷贝/µL。5.13...
