THSPP 0008-2022 茄科植物携带辣椒小果类病毒检测技术规程.pdf

T/HSPP00082022 茄科植物携带辣椒小果类病毒检测技术规程茄科植物携带辣椒小果类病毒检测技术规程 Code of Practice for Detection of Pepper chat fruit viroid carried by Solanaceae plants (发布稿)2022-10-10 发布 2022-11-10 实施 湖 北 省 植 物 保 护 学 会 发布ICS 65.020.20 CCS B16 团体标准 全国团体标准信息平台T/HSPP00082022 I 目次 前言.II 1 范围.-1-2 规范性引用文件.-1-3 术语和定义.-1-4 辣椒小果类病毒分类信息.-1-5 仪器和试剂.-1-仪器设备.-1-主要试剂.-1-6 检测流程图.-1-7 检测方法.-1-样品制备.-2-7.1.1 种子类.-2-7.1.2 种苗类.-2-RNA 提取.-2-RT-PCR 检测.-2-分子杂交.-2-结果判定.-3-8 留样保存与结果记录.-3-留样保存.-3-结果记录.-3-建档.-3-附 录 A（参考性附录）辣椒小果类病毒基本信息.-4-附 录 B（参考性附录）核酸提取方法.-5-附 录 C（参考性附录）分子杂交方法.-6-附 录 D（规范性性附录）辣椒小果类病毒检测流程图.-8-全国团体标准信息平台T/HSPP00082022 II 前言 本文件按照GB/T 1.1-2020 标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则 的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本文件由武汉海关技术中心提出。本文件由湖北省植物保护学会归口。本文件起草单位：武汉海关技术中心、华中农业大学、武汉理工大学、南京海关动植物与食品检测中心、湖北省阿克瑞德检验检测有限公司。本文件主要起草人：李乔、郑剑、解泽峰、王琴、徐文兴、李倩、张建坤、刘振、郑鑫浩、李彬、吴翠萍、周旋、王振华、曾宪东。全国团体标准信息平台T/HSPP00082022 -1-茄科植物携带辣椒小果类病毒检测技术规程 1 范围 本文件规定了辣椒小果类病毒的检测技术规程。本文件适用于番茄、辣椒、马铃薯等茄科植物种子及种苗中辣椒小果类病毒的检测和鉴定。2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 SN/T 2964 植物病毒检测规范 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。4 辣椒小果类病毒分类信息 中文名：辣椒小果类病毒 学名：Pepper chat fruit viroid 类病毒名及缩写：pepper chat fruit viroid，PCFVd 分类地位：马铃薯纺锤形块茎类病毒科（Pospiviroidae），马铃薯纺锤形块茎类病毒属（Pospiviroid）。辣椒小果类病毒的基本信息参见附录A。5 仪器和试剂 仪器设备 电子天平（感量0.001 g）、植物培养箱、研钵、高压灭菌锅、纯水仪、PH仪、旋涡振荡器、高速冷冻离心机、台式小型离心机、恒温加热器、生物安全柜、制冰机、普通PCR仪、电泳仪、凝胶成像仪、杂交炉、交联仪、杂交管、化学发光检测仪、各种量程的可调配移液器（2.5 L，10 L、20 L，200 L，1000 L）、常规冰箱、超低温冰箱等。主要试剂 除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂，实验用水应符合GB/T 6682中一级水的规格。商品化Trizol试剂、三氯甲烷、异丙醇、无水乙醇、反转录酶、DNA聚合酶、脱氧核糖核苷酸、PCR缓冲液、引物和探针、Tris-乙酸电泳缓冲液，硝酸银溶液等。核酸提取相关试剂符合附录B的要求；分子杂交试剂应符合附录C的要求。6 检测流程图 辣椒小果类病毒检测流程图见附录D。检测过程中防扩散、防污染的措施按照SN/T 2964中的规定执行。7 检测方法 全国团体标准信息平台T/HSPP00082022 -2-样品制备 7.1.1 种子类 每份送检样本中选取100200粒种子，表面消毒后，置于铺有吸水纸的白瓷盘或培养皿中，2025、12 h/12 h光暗交替条件下保湿培养直至萌发。随机抽取叶片1 g5 g，置于去RNA酶的研钵中，加入液氮后迅速研磨成细粉状，制成检测样品。7.1.2 种苗类 对于有症状的种苗类样品，选取全部表现症状的叶片；对于无症状的种苗类样品，随机选取。取100 g200 g叶片置于去RNA酶的研钵中，加入液氮后迅速研磨成细粉状，制成检测样品。RNA 提取 取制备好的检测样品100 mg，按照常规Trizol法提进行总RNA提取；以感染PCFVd的茄科植物样本作为阳性对照，以无PCFVd茄科植物样本作为阴性对照，同时进行提取。具体操作步骤参见附录B。核酸提取也可选择相应商业化试剂盒。RT-PCR 检测 7.3.1 cDNA 合成 0.2 mL PCR管中加入DEPC处理去离子水10 L、模板RNA 3 L（50 ng200 ng），随机引物1 L，95（或沸水）水浴7 min，迅速置冰上冷却3 min；然后加5 反转录缓冲液4 L、10 mmol/L dNTPs、40 U/L RNAase抑制剂（Rnasin）0.5 L、200 U/L 反转录酶（M-MLV）0.5 L，混匀后37水浴1 h；反转录结束后瞬时离心，95（或沸水）水浴5 min，冰浴3 min，直接进行PCR扩增。cDNA合成也可采用相应商业化试剂盒。7.3.2 PCR 扩增 反应体系：0.2 mL PCR管中加入10 PCR buffer（含Mg2+）2.5 L，dNTPs（10 mmol/L）2 L，引物（均为10 mol/L）各1.0 L（见表1），5 U/L Taq酶0.5 L，模板cDNA3 L，加DEPC处理水至总体积25 L。每个样品设置两个平行反应，以双蒸水代替模板作为空白对照。表 1 PCR反应特异性引物及序列 引物名称 引物序列（5-3）产物大小（bp）PCFVd150F AAGCTACCCGGGACCCGAGA 150 PCFVd150R GCTTCTCCGCCCGATCTGTT 反应程序：95 5 min；95 30 s，56 30 s，72 30 s，35个循环；72 10 min。也可采用一步法RT-PCR商业化试剂盒，反应体系和反应条件可根据说明书进行适当调整。7.3.3 琼脂糖凝胶电泳检测 制备1.5%琼脂糖凝胶，取1 L加样缓冲液与5 LRT-PCR反应产物混匀进行点样，采用110V电泳35 min后，凝胶成像检测扩增产物。7.3.4 测序分析（可选）对RT-PCR扩增产物进行测序，将测得序列与GenBank数据库中已知的PCFVd序列进行相似性比对分析，验证样品检测结果。分子杂交 采用Roche地高辛标记试剂盒进行核酸探针标记，制备地高辛标记的PCFVd RNA探针，放置于-20备用。取3 L样品核酸，经变性后点于带正电荷的尼龙膜上，晾干后在交联仪上交联3 min。交联固定后的尼龙膜在杂交炉上68进行预杂交1 h，然后加入2 LRNA探针杂交10 h。杂交后进行洗膜，最后按照化学发光法进行杂交检测。具体操作步骤参见附录C。全国团体标准信息平台T/HSPP00082022 -3-结果判定 对照成立的前提下，检测结果按照以下原则进行判定：样品RT-PCR和分子杂交两种检测方法均为阳性，可判定样品中携带有辣椒小果类病毒；样品RT-PCR检测或分子杂交检测结果为阳性，经测序分析验证与已知的PCFVd序列相似性达90%以上，可判断样品携带辣椒小果类病毒；样品RT-PCR和分子杂交两种检测方法均为阴性，可判定样品未携带辣椒小果类病毒。8 留样保存与结果记录 留样保存 检出辣椒小果类病毒的种子、生长苗木样品以及7.1剩余制样于-80冰箱内保存。样品应保存至少6个月。保存期满后，应经高压灭菌后方可处理。结果记录 RT-PCR检测结果电泳照片、分子杂交检测结果照片、测序报告和序列分析结果图应一并保存。建档 建立实完整的实验档案，包括样品的来源、种类、时间，试验的时间、地点、方法、结果及实验人员签字等。全国团体标准信息平台 -4-A A 附 录 A（资料性附录）辣椒小果类病毒基本信息 A.1 寄主范围 已报道的自然寄主是辣椒（Capsicum annuum）、番茄（Solanum lycopersicum）。A.2 地理分布 目前已报道发现 PCFVd 的国家有加拿大、泰国等。A.3 传播途径 PCFVd 可通过嫁接、芽接、刀具机械传播，或通过汁液摩擦接种传播，远距离通过带毒种苗调运传播。A.4 病害症状 辣椒小果类病毒能通过机械传播到番茄（Solanum lycopersicum）植株上，感染的植株叶脉上出现坏死，叶柄、茎与叶片变形和发育迟缓；接种到辣椒（Capsicum annuum）植株上，辣椒产量降低且较大影响辣椒大小。A.5 PCFVd基因组特征 PCFVd基因组为单链环状RNA分子，基因组大小约为348 nt，GC含量高，内部发生配对形成紧密折叠的杆状结构，具有左末端区、致病区、中央保守区、可变区和右末端区五个功能区。全国团体标准信息平台 -5-附 录 B（资料性附录）核酸提取方法 B.1 核酸提取相关试剂 DEPC处理超纯水：取制备好的去离子水500 mL，加入500 L DEPC摇床震荡过夜，高温高压灭菌后室温保存；1 mol/L Tris-HCl（pH 8.0）：称取12.11 g Trisbase，加50 mL DEPC处理超纯水溶解，用浓HCl调pH值至8.0，定容至100 mL，高温高压灭菌后室温保存；0.5 mol/L EDTA（pH 8.0）：称取18.61 g Na2EDTA2H2O，加80 mL处理超纯水溶解，用约2 g NaOH调pH 值至8.0，加DEPC 100 L，定容至100 mL，摇床震荡过夜，高温高压灭菌后室温保存；10TE（pH8.0）：取1 mol/L Tris-HCl（pH 8.0）10 mL和0.5 mol/L EDTA（pH 8.0）2 mL，加50 mL DEPC处理超纯水溶解，定容至100 mL，高温高压灭菌后室温保存。B.2 核酸提取 称取7.1制备的检测样品100 mg，转入已灭菌的去RNA酶离心管；立即加入1 mL Trizol，涡旋振荡15 s，室温静置15 min；加400 L氯仿，上下颠倒混匀，室温静置2 min，4 12000 r/m离心15 min；取上清于新的离心管中，加无加入等体积的异丙醇沉淀，轻微颠倒，-20沉降1h；12000 r/m离心15 min；弃上清，沉淀中加1 mL 预冷的75%酒精，上下颠倒10次，12000 r/m离心5 min，弃上清；瞬间离心20 s，吸去多余液体，室温干燥5-10 min，加30 L DEPC处理的去离子水溶解，-80 冰箱保存备用。也可选择市售商品化提取试剂盒进行核酸提取。全国团体标准信息平台 -6-附 录 C（参考性附录）分子杂交方法 C.1试剂与材料 C.1.1核酸杂交相关试剂 20SSC：称取 175.3 g NaCl，88.2 g 柠檬酸钠2H2O，溶解于 800 mL 去离子水，用 HCl调 pH 值至 7.0，最后用定容至 1 L，高温高压灭菌后室温保存；50Denhardts 溶液：称取 1 g Ficoll 400，1 g PVP-40，1 g BSA，溶解于 80 mL 去离子水，定容至 100 mL，过滤除菌及杂质后-20 贮存；预杂交液：6 SSC、5 Denhardt 溶液、50%(w/v)Formamide、0.5%(w/v)SDS、100 g/mL 鲑鱼精 DNA（用前加热变性后加入）；杂交液：预杂交液中加入 DIG-RNA 探针，稀释成适当浓度；封闭液：将 0.73 g Na