SNT 3767.27-2014 出口食品中转基因成分环介导等温扩增（LAMP）检测方法 第27部分：水稻T2A-1品系.pdf

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准sN/T3767.27-2014出口食品中转基因成分环介导等温扩增(LAMP)检测方法ffi 27 frlr)d(fH T2A1 HaLoop-mediated isothermat amplification detection method for geneticallymodified components in food for export-Part 27:Rice T2A-114-0卜13发布14-08-01实施国局和蚰土淼踬民骷人龇华颏中国发布sN/T3767,27-2014亠刖曰SN/T3767出口食品中转基 因成分环介导等温扩增(LAMP)检测方法 共分为30部分:第1部分:通 用要求和定义;第2部分:筛 选方法;第3部分:玉 米Bt11品系;第4部分:玉 米Bt176品系;第5 部分:玉米G A 2 1 品系;第6 部分:玉米M I R 1 6 2 品系;第7 部分:玉米M I R 6 0 4 品系;第8 部分:玉米M O N 8 1 0 品系;第9 部分:玉米M O N 8 6 3 品系;第1 0 部分:玉米M O N 8 8 0 1 7 品系;第1 1 部分:玉米M O N 8 9 0 3 4 品系;第1 2 部分:玉米T 2 5 品系;第1 3 部分:玉米3 2 7 2 品系;第1 4 部分:玉米5 9 1 2 2 品系;第1 5 部分:大 豆A 2 7 0 4 2 晶系;、第1 6 部分:大豆A 5 5 4 7 1 2 7 品系;第1 7 部分:大豆D P 3 5 6 0 4 3 品系;第1 8 部分:大豆G T S 4 0 3 2 品系;第1 9 部分:大豆M O N 8 9 7 8 8 品系;第部分:水 稻Bt63品系;第21部分:水 稻KF6品系;第22部分:水 稻KF8品系;第23部分:水 稻KMD品系;第24部分:水 稻LLRICE62品系;第25部分:水 稻M12品系;第2 6 部分:水稻T 1 G 1 9 品系;第27部分:水 稻T2A1品系;第2 8 部分:小 麦B 7 3-6 品系;第29部分:甜 菜H71品系;第30部分:油 菜RT73品系。本部分为SN/T3767的第27部分。本部分按照GB/T1,109给出的规则起草。请注意本文件的某些 内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本部分 由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位:中 国检验检疫科学研究院、中华人 民共和国厦 门出人境检验检疫局、中华人 民共和国广东出人境检验检疫局。本部分主要起草人:黄 文胜、邓婷婷、吴亚君、陈颖、李新实、韩建勋、傅凯、赵贵明、王斌、陈双雅、李志勇。IsN/T 3767,27-2014出口食品中转基因成分环介导等温扩增(LAMP)检测方法第27部 分:水 稻T2A-1品系1 范 围SN/T3767本部分规定了稻谷初筛检测方法。性 的环介 导等温 扩增(LAMP)本部分适用于稻谷和大米中转坝 刂。本方法的定性检测低限为0.5%(质量分数)。2 规 范性 引用文件下列文件对于本文件的应用牛,仅 注 日期 的版本适用于本文本文件。件。凡是不注 日期的引用文件,其GB/T6082 分析实验室用水GB/T19495.2 转基 因 产 品 检 测GB/T19495.3 转基 因 产 品 检 测实验室技术要求GB/T19495.7 转基 因 产 品 检提取和制SN/T3767.2zO14 出 白食因成MP)检测方法 第2部分:筛选方法3 防 污染措施环介导等温扩增检测过程的4 抽样与制样按照G B/T 1 9 4 9 5.7 的规定执行。5 核 酸提取纯化按照G B/T 1 9 4 9 5.3 的规定执行。6 LAMP检测方法6.1 原理6.1.1 一般原理根据转基因水稻T2A1品系外源基因和水稻边界序列设计特异性 内、外引物各一对(特 异性 目标1sN/T3767.27-2014序列和引物碱基序列参见附录A),特异性识别 目标序列上的六个独立 区域,并 设计一对环引物提高反应效率。在反应缓冲液中脱氧核糖核酸三磷酸、寡核苷酸引物在B踮聚合酶 的作用下启动循环链置换反应,在 特异 目标序列启动互补链合成,在 同一链上互补序列周而复始形成有很多环 的花椰菜结构 的茎-环DNA混合物;从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg2+结合,产 生副产物(焦 磷酸镁)形成乳 白色沉淀,加 人显色液,即 可通过颜色变化观察判定结果。6,1.2 显色液显色原理在LAMP反应体系中加人预先混合的钙黄绿素和锰离子,未 发生反应时锰离子与钙黄绿素结合,钙黄绿素的荧光被淬灭,呈 现橙色。当扩增反应发生时,扩 增过程中产生的焦磷酸根离子可与锰离子结合,形 成不可逆的沉淀物,将 锰离子从钙黄绿素上释放下来,从 而使钙黄绿素恢复荧光,同 时体系中的镁离子与钙黄绿素结合,进一步加强钙黄绿素的荧光,可 在365nm紫外光激发下散发出约510nm的荧光,颜 色也 由橙色转为绿色。6.2 仪器和设备6.2,1 超纯水发生器。6,2.2 水浴锅或加热模板:6 5.0 0.5 和8 0.0 o,5。6.2.3 离心管:0.1 m L、1,5 m L。6.2,4 移液器:量 程0,5 u L 1 0 u L;量程1 0 u L 1 0 0 u L;量程1 0 0 u I 1 0 0 0 u L o6,2,5 计时器。6.3 试剂和材料 、除另有规定外,所 有试剂均为分析纯或生化试剂。6.3.1 实验用水:应 符合GB/T6682中一级水的规格。6.3,2 d N T P s 溶液:每 种核苷酸浓度1 0 m m o l/L。6,3.3 B茁DNA聚合酶(如:NEB公司或具有同等效果 的DNA聚合酶):酶浓度8U/uL。6.3,4 10ThermolPol缓冲液:含200mmol/LT1 is H(pH值为8.8)、100mmol/L硫酸铵、100mmol/L氯化钾、mm。1/L硫酸镁、1%Tron 100。6.3.5 硫酸镁溶液:50mmol/L。6.3,6 甜菜碱:5mol/L。6,3,7 显色液:钙 黄绿素(Calcon)。6.3,8 引物:根 据转基因水稻T2肛1品系外源基因和水稻边界序列设计一套特异性引物,包 括外引物1,外引物2,内引物1和内引物2,环引物1和环引物2。夕 卜 引 物1(F3,5-3):GCGGGATATCATTTGCCTGTAAC夕 卜 引 物2(B3,5-3):CCGATGAGGCTACCCACCTTCTT内 引 物1(FIP,53):TG叹 CGTCGGG胛 TGAKCG CG%A%CWGAA内 引 4勿2(BIP,5-3):AATGGATGGAGTGGAAGCGCACGCTCGACACAGTGCCGACCACT环引牛勿1(FIP,5-3):GCCGCTGTTCAGCACGTTGT环 引 物2(BLP,5-3):GGACCACAGCCTCTACGTCG6.4 实验步骤6,4,1 阴性对照、阳性对照和空白对照的设置6.4.1.1 阴性对照:2sN/T3767,27-2014采用不含有待测基因序列的植物基因组DNA为模板。6.4,1,2 阳性对照:采用含有待测基因序列的植物DNA作为模板或含有 目的基因序列的质粒DNA代替DNA模板。6.4.1.3 设两个空 白对照:提取DNA时设置的提取空 白对照(以水代替样品);LAMP反应的空 白对照(以 DNA溶解液代替DNA模板)。6.4.2 内源基因检测LAMP检测前应先进行 内源基因检测,结 果 阳性则表 明从样 品中提取 的DNA可以进行外源基 因检测;否 则应重新进行DNA提取和纯化。内源基 因的检测参照SN/T3767.214的规定进行。6.4.3 水稻T2A-1品系LAMP反应体系LAMP反应体系见表1。每个样品各做2个平行管。加样时应使样 晶DNA溶液完全加人反应液中,不 要粘附于管壁上。在反应体系配制完成后,将1uL显色液滴在管盖 内侧,盖 管盖时应小心,防 止显色液混合进人反应液中。表1 水稻T2A-1品系LAMP反应体 系6,4.4 LAMP反应参数65.00,5恒温扩增70min,80.00,55min使酶灭活,反 应结束。6.4.5 显色反应反应结束后,在 黑色背景下立 即进行颜色观察。组 分工作液浓度力 口 本 莘 廑 蕙/uL反应体系终浓度T h e r m l P 1 缓冲液l夕 卜 引钐 歹1(F3)5 Vmol/Lo,2uml/L夕 卜 引杉 92(B3)5umol/L1,00,2 lLmoI/L内引物 1(F I P)40umol/L1,01,6umol/L内引物2(BIP)40umol/L1.01.6 u m l/I 冫环 引 物1(FLP)10uml/L1.0o.4 u m o l/L环 引 物2(BLP)10umol/L1.00.茌u m l/LdNTPs1 0 u m o l/L41,6mmol/L甜莱碱5moI/L40,8mml/L硫酸镁1 0 0 m m o l/L0,56mmol/L(包 括缓冲液 中所含硫酸镁)钙黄绿素(C a l c o n)2,5 m m o l/Ll0,1 m m l/LB s 莎 D N A 聚合酶8U/uLl0,32U/uLDNA模板700 ng/pL2B ng/pL水补足至 25,0sN/T3767.2720146.5 质量控制6.5.1 基本原则:实 验室中设置的各种对照LAMP检测结果应符合 以下情况。否则,任一种对照如果出现非下述正常结果,应 重做实验。6.5.2 空白对照:反 应管 中液体呈橙色。6.5.3 阴性对照:反 应管 中液体呈橙色。6.5.4 阳性对照:反 应管中液体呈绿色。7 结果判断和确证7.1 待检样品2个平行样反应管果为阴性。结果正常,可 判断该样 品检测结7.2 待检样品2个平行样反应管 中液验对照结果正常,可 判断该样 品转基 因水稻KF8品系初筛 阳性,还 应通过对外进行序列测定等相关方法进行确证。8 结果表述8.1 检测结果为阴性,表 述为“该8.2 检测结果 为转基 因水稻T2附录A)。情况进行结果 判 断和表述(见sN/T3767.27-2014附 录 A(资 料性 附录)转基 因水稻T2A-1品系基 因序列A。1 转基 因水稻T2A-1品系外 源基 因和水稻边界序 列1 GOGGG咖G叩GcCTGT入ACCGGTTTcCT AAGCG护 屺 cCCC00C0廴 AAGGT61 AAG叮G屺 峨TGCTGAAG纹GC03令 kG)AC0CG叮CTGAC c 巛 唧GTc121 GTGGCCCACGATC0G九GGAATGG181 fGGAGTGGTGGTCGGGCTGTGTCG241 AGCTTCCTGCTGA。2 引物 碱 基 序 列及 构 成F3:GCGGGATATCAB3:CCGATGAGGCTACCCFIP:GCCGCTGTTCAGCABLP:GGACCACAGCcTCTF1cFIP:BIP:TGTAGGCGTCGCAGATGGAATGGATGGAGGGTAAGGCTATGAGCCGACCACT叮一0点卜卜zHHHTs中华人民共和国出人境检验检疫行 业 标 准出口食品中转基因成分环介导等温扩增(LAMP)检测方法第27部分:水 稻T2A-1品系sN/T3767,272014中 国 标 准 出 版 社 出 版北 京市 朝 阳区和平 里西 街 甲2号(100029)北京 市 西城 区三里河 北 街16号(100045)总编 室:(010)68533533网址w w w。s p C,n e t,c n中 国标 准 出版社 秦 皇 岛 印刷 厂 印刷开本88012301/16 印张0,75 字数10千字14年12月第一版 1在年12月第一次印刷印数1-1300书 号:1 5 5 0 6 6 2 7 4 8 2 定价1 6.0 0 元3767,27-2014