面包果DNA条形码筛选与遗传多样性分析_高效梅.pdf

研究报告Research Report面包果 DNA 条形码筛选与遗传多样性分析高效梅1,2伍宝朵1胡丽松1,3谭乐和1,3吴刚1,3*1 中国热带农业科学院香料饮料研究所,万宁,571533;2 云南农业大学热带作物学院,普洱,665000;3 中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所,国家热带植物种质资源库,海口,570100*通信作者,摘要本研究以 30 份面包果资源为研究对象，对 ITS、g3pdh、marK、trnL-F 和 rbcL 5 种 DNA 条形码序列进行扩增测序分析，通过多序列比对分析序列特征。利用筛选出的理想 DNA 条形码序列进行遗传距离分析，构建 NJ 邻接系统进化树。结果表明，g3pdh 和 ITS 序列变异位点较多，变异没有规律性；matK 和 rbcL 序列保守，变异位点少且集中于某些种质；trnL-F 序列较保守，部分变异可作为识别特征。基于 trnL-F 序列分析面包果资源遗传距离为 00.033，平均遗传距离为 0.010。基于系统发育树结果，可将面包果资源聚为 4 个分支，推测 XYS1-3、XYS1 和 YBG 可能引种于印度尼西亚，XYS2、XYS3、XYS5 和 XYS6 可能引种于越南、泰国等东南亚地区。综上所述，trnL-F 序列更适合用于面包果遗传多样性分析，可用于部分种质的鉴别。关键词面包果;DNA 条形码;trnL-F 序列;序列特征分析;系统发育树DNA Barcode Screening and Genetic Diversity Analysis of BreadfruitGao Xiaomei1,2Wu Baoduo1Hu Lisong1,3Tan Lehe1,3Wu Gang1,3*1 Spice and Beverage Research Institute,Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences,Wanning,571533;2 College of Tropical Crop Science,Yunnan Agricultural University,Puer,665000;3 National Tropical Plants Germplasm Resource Center,Tropical Crops Genetic Resources Institute,Chinese Academy of Tropical Agriculture Sciences,Haikou,570100*Corresponding author,DOI:10.13271/j.mpb.021.004719AbstractIn this study,thirty breadfruit resources were used as the materials.Five DNA barcodings for ITS,g3pdh,marK,trnL-F and rbcL were sequenced and analyzed the sequence characteristics through multiple sequencealignment.The neighbor joining(NJ)methods was used to construct phylogenetic trees and Kimura two-parameter(K2-P)model was used to calculate the genetic distance of different resources.The results showed that the g3pdhand ITS sequences had many variation sites without regularity,and the matK and rbcL sequences had few variationsites and concentrated in some germplasms.In addition,trnl-F sequences were relatively conservative,and somevariation sites could be used as recognition features.Based on trnL-F sequence analysis,the genetic distance ofbreadfruit resources was 00.033,and with average of 0.010.Based on the results of phylogenetic tree,breadfruitresources could be clustered into four branches.Furthermore,we speculated that XYS1-3,XYS1 and YBG may beintroduced from Indonesia,and XYS2,XYS3,XYS5 and XYS6 may be introduced from Southeast Asia such asVietnam or Thailand.In conclusion,trnL-F sequence was more suitable for breadfruit genetic diversity analysisand could be used to identify some breadfruit germplasms.KeywordsBreadfruit;DNA barcode;trnL-F sequence;Sequence characteristic analysis;Phylogenetic tree基金项目：本研究由海南省重点研发计划项目(ZDYF2020049)、国家热带植物种质资源库木本粮食种质资源分库项目(NTPGR-C2022-018)和热科院揭榜挂帅项目(1630142022001)共同资助引用格式：Gao X.M.,Wu B.D.,Hu L.S.,Tan L.H.,and Wu G.,2023,DNA barcode screening and genetic diversity analysis of bread-fruit,Fenzi Zhiwu Yuzhong(Molecular Plant Breeding),21(14):4719-4728.(高效梅,伍宝朵,胡丽松,谭乐和,吴刚,2023,面包果DNA 条形码筛选与遗传多样性分析,分子植物育种,21(14):4719-4728.)分子植物育种，2023 年，第 21 卷，第 14 期，第 4719-4728 页Molecular Plant Breeding,2023,Vol.21,No.14,4719-4728分子植物育种Molecular Plant Breeding面包果是桑科(Moraceae)菠萝属(Artocarpus)特色热带粮食作物，原产于南太平洋的玻利尼西亚和西印度群岛，是当地主要的粮食作物(吴刚等,2017,中国南方果树,46(4):99-101)。面包果用途广，果实营养丰富，富含淀粉、维生素、膳食纤维、蛋白质和矿物质等，成熟果实吃法多样，果肉松软，清甜可口，口感、质地和风味胜似面包，是天然的健康食品，素有“长面包的树”之美称(吴刚等,2018,中国热带农业,(2):39-44)。木材轻盈耐用，树姿美，可作庭院树、行道树等，常植于房前屋后，村庄边缘和公路边等，商业化集中连片种植相对较少(符红梅和谭乐和,2008,中国南方果树,37(4):43-44)。中国海南、广东、广西、台湾、云南等地均有种植。面包果是农林作物复合栽培和庭院种植的重要组成部分(Zerega et al.,2015;吴刚等,2017,中国南方果树,46(4):99-101)，其经济价值高，具有良好的开发潜力和市场前景。美国国家热带植物园(National Tropical BotanicalGarden,NTBG)保存了丰富的面包果种质资源，Jones等(2013)通过形态鉴定将其分为 A.camansi Blanco、A.altilis(Parkinson)Fosberg和 A.mariannensis Trcul，早期 A.altilisA.mariannensis 杂交种和驯化 A.altilisA.mariannensis 杂交种。面包果按有无种子分为有核和无核两类。有核型面包果，通称硬面包果或面包坚果，果实含有种子。根据中国收集保存的资源，目前，将硬面包果分为硬面包果型和硬面包果型，硬面包果型果实含有大而多的圆形白色种子，常见于园林绿化栽培，食用价值不大；硬面包果型果实含有硬质的白色果肉，内有少许种子，在中国较为少见，可食用，常保存于资源圃(谭乐和,2017,中国农业出版社,pp.121-122;吴刚和谭乐和,2021,中国农业出版社,pp.17-34)。无核型面包果，通称面包果，无种子，食用价值大，常用于商业化种植，在海南万宁兴隆较为常见(谭乐和,2017,中国农业出版社,pp.121-122;吴刚和谭乐和,2021,中国农业出版社,pp.17-34)。DNA 条形码技术(DNAbarcode)是用生物体DNA中一段保守片段对物种进行快速定位、准确鉴别的技术，具有操作简便、快速和准确性高等特点，现已广泛应用于植物鉴定、分类、生物多样性评估、遗传多样性分析、系统发育、濒临灭绝植物保护等领域(裴男才和陈步峰,2013;付涛等,2016;杨倩倩等,2018)。董斌等(2021)利用 rbcL 和 matK 对 82 份剑麻种质资源进行分析和聚类，发现 matK 序列具有更高的遗传多样性，适用于剑麻种质鉴别。方振名等(2022)利用 ITS、ITS2 和 matK 序列对夹竹桃科 5 个属的部分资源进行分析，建议 matK 序列可作为 DNA 条形码鉴定的候选序列。国外有学者对面包果遗传多样性开展了一些研究。Williams 等(2017)利用 8 个 DNA 条形码对菠萝蜜属进行系统发育和生物地理学研究，支持婆罗洲是菠萝蜜属植物多样化的中心，可能是菠萝蜜属向多个方向扩散和多样化的中心。Zerega等(2004)利用 AFLP 标记绘制了 200 多个面包果品种的DNA 指纹图谱，认为面包果至少有两个起源地。国内鲜有关于面包果种质鉴定相关报道，仅有关于面包果开发前景和应用价值(符红梅和谭乐和,2008,中国南方果树,37(4):43-44)、引种试种及营养成分(吴刚等,2017,中国南方果树,46(4):99-101;吴刚等,2018,中国热带农业,(2):39-44)、淀粉特征(Li et al.,2022)等研究。因此筛选出适合面包果的 DNA 条形码，对面包果分类、资源保护和品种选择具有重要意义。面包果形态特征较为相似，目前中国收集的面包果资源引种来源不清，还没有进行系统的分类和遗传多样性评估。为了探究面包果资源之间的亲缘关系和分类，本研究基于 DNA 条形码技术对中国热带农业科学院香料饮料研究所收集的部分面包果资源进行遗传距离及系统发育分析，从分子手段探讨它们之间的亲缘关系，从而为面包果种质资源分类鉴定、优良品种选育和利用提供参考。1结果与分析1.1 DNA条形码引物PCR扩增选取 4 份面包果资源用于候选 DNA 条形码筛选，分别是 W1、G2、SLLK、KML。从 10 对条形码引物中筛选出 5 对(表 1)扩增条带清晰、无杂带的引物用于供试面包果资源群体扩增。筛选出的 5 对引物群体扩增成功率均为 100%。trnL-F 序列扩增结果(图 1)。1.2 DNA条形码序列特征分析通过序列对比分析结果可以看出，g3pdh、ITS、matK、rbcL 和 trnL-F 序列保守位点占比均大于3