miR-107靶向FGFR...T通路抑制胃癌耐药细胞迁移_蒋露.pdf

mi-107 靶向 FGFL1/AKT 通路抑制胃癌耐药细胞迁移蒋露1张燕1任伟宏2(河南中医药大学1 第一临床医学院，河南郑州450046;2 第一附属医院检验科)摘要 目的检测胃癌敏感和耐药细胞迁移能力的强弱，探究 mi-107 靶向成纤维细胞生长因子受体样蛋白(FG-FL)1/蛋白激酶 B(AKT)通路调节胃癌耐药细胞迁移。方法利用划痕和 transwell 小室实验验证胃癌敏感和耐药细胞的迁移;采用荧光定量聚合酶链反应(PC)，Western 印迹检测敏感和耐药胃癌细胞中 mi-107、FGFL1/AKT 通路活性及迁移相关蛋白 E-钙黏附蛋白(Cadherin)、波形蛋白(Vimentin)和基质金属蛋白酶(MMP)9 的表达;利用荧光素酶报告实验鉴定mi-107 与 FGFL1 之间的靶向关系;将胃癌细胞耐药株分为 mimic NC 组、mi-107 mimic 组、NC 组和 siFGFL1 组，荧光定量PC、Western 印迹检测胃癌耐药细胞中 FGFL1 mNA 表达水平、FGFL1/AKT 通路活性及迁移相关蛋白表达水平;划痕和transwell 小室实验测定胃癌耐药细胞迁移能力的变化。结果与胃癌敏感细胞相比，胃癌耐药细胞迁移能力更强，且 mi-107呈明显低表达，FGFL1 mNA 和蛋白水平显著高表达，AKT 活性(p-AKT 水平)与 Vimentin、MMP9 蛋白水平显著高表达，E-Cadherin 蛋白水平显著低表达(均 P0.05);与 mimic NC 组和 NC 组相比，在 mi-107 mimic 组、siFGFL1 组中胃癌耐药细胞中 FGFL1 mNA 和蛋白表达水平显著下调，AKT 活性与 Vimentin、MMP9 蛋白显著下调，E-Cadherin 显著上调，胃癌耐药细胞迁移能力也显著下降(均 P0.05)，且荧光素酶报告实验表明 FGFL1 是 mi-107 的下游靶标分子。结论胃癌耐药细胞迁移能力更强，mi-107 通过靶向调节 FGFL1/AKT 通路活性调控迁移相关蛋白的表达，进而调控胃癌耐药细胞的迁移。关键词 胃癌耐药细胞;mi-107;成纤维细胞生长因子受体(FGF)L1/蛋白激酶 B(AKT);迁移中图分类号 735.2;73-37 文献标识码 A 文章编号 1005-9202(2023)03-0705-06;doi:10.3969/j.issn.1005-9202.2023.03.049基金项目:河南中医药大学博士科研启动基金(SBSJJ2019-26)通信作者:任伟宏(1969-)，男，博士，教授，硕士生导师，主要从事分子免疫研究。第一作者:蒋露(1988-)，女，博士，讲师，主要从事肿瘤基础研究。胃癌是全球第五大最常见的恶性肿瘤，也是癌症相关死亡的第三大主要原因，对人类的生命健康构成了严重威胁1。由于缺乏有效的生物分子标志物，胃癌通常被发现时已为晚期，其 5 年生存率为20%30%2，3。包括遗传学，表观遗传学和环境在内的多种因素均能影响胃癌的发生发展4。现阶段胃癌的临床治疗仍缺乏有效的手段，主要还是采用手术并配合化疗或者化疗与靶向治疗联合的方式，因此不可避免地可能会产生耐药现象5，已有报道表明，耐药的胃癌细胞可能更易发生转移6。而影响胃癌转移的因素众多，涉及多条信号通路的调控及多种迁移相关蛋白表达的调节。因此，探究胃癌敏感和耐药细胞迁移的强弱及其调控机制对改善胃癌的治疗提供了临床参考。微小 NA(mi)是长度为 20 nt 左右是非编码小 NA，通过与靶基因mNA 特异性结合进行转录后负调控靶基因表达7。有研究表明，mi-107 可以调控多种肿瘤的发生发展、增殖、转移等多个生物学过程8 10。成纤维细胞生长因子受体(FGF)5，也被称为 FG-FL1，在调节细胞增殖、分化、黏附、融合等过程中发挥重要作用11。有报道表明，FGFL1 也能调控一些肿瘤细胞的转移过程12，13，但其是否能调节胃癌细胞的迁移及其与 mi-107 之间的相互关系并不十分清楚，且 mi-107 是否通过靶标 FGFL1 来调节胃癌细胞的迁移，并没有相关报道。本研究以胃癌敏感和耐药细胞为研究对象，探究 mi-107 和 FGFL1对其转移的影响，并进一步阐明其调节关系。1材料与方法1.1材料人胃癌敏感株和 5-氟尿嘧啶耐药株细胞(SGC-7901，SGC-7901/5-Fu)购自上海慧颖生物科技有限公司;PMI1640 培养基、胰蛋白酶、青链霉素、IPA 组织/细胞裂解液、蛋白酶抑制剂和苯甲基磺氟(PMSF)购自索莱宝公司;opti-减/低血清培养基(MEM)购自 Gibco 公司;胎牛血清(FBS)购自 Bi-ological Industries 公司;TIzol 购自 Life Technologies公司;mNA 逆转录试剂盒购自 Thermo Fisher 公司;SYB green Premix Ex TaqTM荧光定量检测试剂盒购自 TaKaa 公司;miNA 提取纯化试剂盒、mi-NA cDNA 合成试剂盒及 miNA qPC 定量分析试剂盒购自康为世纪生物有限公司;Lipofectamine2000 购自 invitrogen 公司;24 孔悬挂 transwell(孔径8 m)购自 Millipore 公司;抗-FGFL1 抗体购自 BBI公司;抗-GAPDH 抗体和抗兔二抗购自 Proteintech507蒋露等mi-107 靶向 FGFL1/AKT 通路抑制胃癌耐药细胞迁移第 3 期公司;二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量试剂盒购自碧云天生物技术有限公司;荧光素酶活性检测试剂盒购自 Genecopoeia 公司。1.2划痕实验将胃癌 SGC-7901，SGC-7901/5-Fu或转染的 SGC-7901/5-Fu 细胞种于 12 孔板，待细胞融合达 95%以上，用无菌小移液器滴头横竖划细胞单层，形成划痕，磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤除去划掉的细胞碎片，用 1%血清 PMI1640 培养基进行培养，分别在0 h 和24 h 时间点进行拍照记录，计算细胞相对迁移距离:(0 h 划痕距离24 h 划痕距离)/0 h划痕距离100%。1.3Transwell 小室实验将胃癌 SGC-7901，SGC-7901/5-Fu 或转染的 SGC-7901/5-Fu 细胞种于 6 孔板，随后用基础细胞培养基饥饿培养 24 h。将 Tran-swell 小室(孔径8 m)悬挂于24 孔板，下室20%FBS的 PMI1640 培养基为诱导剂，上室种 200 l 胃癌细胞悬液，用无血清 PMI1640 培养基培养。培养 48 h后，用棉签擦去滤膜上面未迁出的细胞，用 4%多聚甲醛和0.1%结晶紫对穿过孔径的滤膜下面的细胞进行固定和染色，倒置显微镜进行拍照，并计数。1.4细胞转染将胃癌 SGC-7901/5-Fu 耐药细胞接种到 12 孔或 6 孔板中，并分为 4 组:mimic NC组、mi-107 mimic 组、NC 组和 siFGFL1 组。所用NA 由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，mi-107 mimic 序列为:上游 5-AGCAGCAUUGUA-CAGGGCUAUCA-3，下游 5-AUAGCCCUGUACAAUGCUGCUUU-3;siFGFL1 序列为:上游 5-CGACG-GCUCCUACCUCAAUAATT-3，下游 5-UUAUUGAG-GUAGGAGCCGUCGTT-3;相对应的对照 NA 由生工生物工程(上海)股份有限公司赠送。培养细胞融合度达 70%左右，吸弃 PMI1640 培养基，加入一定体积 opti-MEM 培养基，用 Lipofectamine2000 作为转染试剂，用 opti-MEM 分别稀释 Lipofectamine2000和 NA，并将稀释的 NA 逐滴加入到稀释的转染试剂中，静置 10 min;将 NA-Lipofectamine2000 混合物逐滴滴加到 SGC-7901/5-Fu 耐药细胞中，轻轻混匀，6 h 后，弃上清，加入 10%FBS PMI1640 完全培养基培养。1.5qPC 检测 FGFL1 mNA 和 mi-107 水平胃癌 SGC-7901，SGC-7901/5-Fu 及 转 染 的 SGC-7901/5-Fu 细胞沉淀重悬在 1 ml Trizol 中。然后将混合物在室温放置 5 min，加入 200 l 氯仿，剧烈震荡1 min，12 000 r/min，4，离心 15 min。再向上清中加入500 l 异丙醇，剧烈震荡1 min，12 000 r/min，4，离心10 min。用75%乙醇洗涤沉淀2 次，干燥，溶于焦碳酸二乙酯(DEPC)水中。测定 NA 样品浓度，用 mNA 逆转录试剂盒将 NA(2 g)反转录为 cDNA。用 SYB green Premix Ex TaqTM试剂盒检测 FGFL1 基因相对表达水平，内参基因为 GAP-DH。FGFL1 引物序列为:上游 5-GTGTGAGGAG-CATGGGTCTC-3和下游5-GTGTGTGTGTGTGTGT-GTGGA-3，GAPDH 引物序列为:上游 5-CGCTGAG-TACGTCGTGGAGTC-3和下游 5-GCTGATGATCTT-GAGGCTGTTGTC-3。按照 miNA 提取纯化试剂盒，miNA cDNA 合成试剂盒及 miNA qPC 定量分析试剂盒的说明提取胃癌 SGC-7901，SGC-7901/5-Fu 细胞的 miNA，并进行 miNA 的加 Poly(A)尾修饰的过程，修饰后的 miNA 再进行逆转录，最后进行定量检测，其中 miNA cDNA 合成试剂盒须与miNA qPC 定量分析试剂盒配套使用，试剂盒提供了下游引物。mi-107 上游引物序列为:5-CG-CAGCAGCATTGTACAGGGCTATCA-3，内参基因 U6上游引物序列为:5-CCGAGAGAAGATTAGCATG-GCCCCTG-3，PC 引物序列由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。1.6Western 印迹检测相关蛋白表达用细胞裂解液(IPA 裂解液，1%蛋白酶抑制剂和 1 mmol/LPMSF)重悬胃癌 SGC-7901，SGC-7901/5-Fu 细胞，加至玻璃均浆器中进行均浆破碎，将裂解液 4，5 000 r/min离心 15 min，取上清，测定蛋白浓度。将细胞裂解液在 100下煮沸 10 min 变性，进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，恒流将蛋白转移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，用 5%牛血清白蛋白(BSA)封闭 1 h，4 过夜孵育抗 FG-FL1 抗体(1 400)，抗 p-AKT 抗体(1 500)，抗 AKT抗体(1 2 000)，抗 E-钙黏附蛋白(Cadherin)抗体(1 1 000)，抗波形蛋白(Vimentin)抗体(1 500)，抗基质金属蛋白酶(MMP)9 抗体(1 1 000)和抗 GAP-DH 抗体(1 3 000)，洗涤后与辣根过氧化物酶(HP)标记的羊抗兔或羊抗鼠二抗(1 5 000)室温孵育 3 h，用增强型电化学发光(ECL)液进行曝光，并用 ImageJ 软件进行灰度值分析。1.7荧光素酶报告实验用 TargetScan(http:/www.targetscan.org/vert_72/)预 测 出 mi-107 对FGFL1 的靶标结合位点有 2 处，并用高斯荧光素酶(Gluc)报告载体(pEZX-MT05)构建了 FGFL1野生型表达载体(插入序列为:5-cTGGACACA-CAGATAATGCTGCc-3 和 5-aCACACACACAGATA-ATGCTGCc-3)和突变型表达载体(插入序列为:5-cTGGACACACAGATTACGACGc-3 和 5-aCACACA-607中国老年学杂志 2023 年 2 月第 43 卷CACAGATTTACGA