此资料由网络收集而来，如有侵权请告知上传者立即删除。资料共分享，我们负责传递知识。SPSS16.0和SAS实验准备材料与方法窗体顶端准备材料与实验方法1.1载体与菌株（1）载体：pMD18-T载体购于TaKaRa公司。pcDNA3.1+载体购于Invitrogen公司。其中pcDNA3.1+的载体结构如下列图（2）大肠杆菌菌株（用于克隆）：DH5α，购于TransGen公司。（3）细胞系：采用人羊膜上皮细胞（WISH细胞），来源于本试验室的冻存细胞。1.2PCR新增产物的检测和回收将5μL标准分子量的DNAMarkerDL2022作为参考，所以首先需取1.5%的琼脂糖凝胶用来检验并测试PCR扩增所产生的物质，其次将5μL的生成物质全部参加凝胶孔内。随后需要将凝胶孔内物质进行电泳，需要的电流是200mA，电压是200V，结束后应将凝胶孔内的成像结果进行观察并进此资料由网络收集而来，如有侵权请告知上传者立即删除。资料共分享，我们负责传递知识。行拍摄记录。此次实验需要在室内常温下进行，该实验方法对各种浓度回收中的琼脂糖凝胶60bp-20kb的DNA片段都有一定的实用。琼脂糖凝胶回收：参考Omerga胶回收试剂盒说明书1.3构建表达载体和酶切回收1.3.1pMD18-T载体连接与转化将回收的PCR产物连入pMD18-T载体上，根据说明书进行操作1.3.2质粒的提取连接pMD18-T，其中质粒小量的提取可以参考Omega公司的质粒小提试剂盒1.3.3重组表达质粒的构建将载体，即pMD18-T和pcDNA3.1+，进行双酶切，其中很关键的是该载体需要含有质粒。1.3.4提取去内毒素和表达质粒的重组参考Omega公司的Endo-freePlasmidMiniKitII(D6950-01)的说明书进行。内毒素的提取和重组。1.4细胞培养（1）首先需将细胞进行复苏（2）对细胞进行培养，培养的过程只需常规操作进行培养（3）将培养后的细胞冻存即可1.5细胞转染此次实验在细胞培养之后需将细胞进行转染转染操作参此资料由网络收集而来，如有侵权请告知上传者立即删除。资料共分享，我们负责传递知识。考：LifeTechnologies公司的LipofectamineTM3000和Invitrogen公司的RNAiMAX1.6提取细胞总RNA在提取细胞RNA的过程需参考Omega的RNA提取说明书。1.7实时荧光定量分析在提取RNA后，需要将其测定浓度，并将其进行电泳检测，目的是检测质量是否合格，合格状态应是提取后的RNA仅有两条带，分别是28S和18S，并且18S的亮度应是28S亮度的一半。随后进行反转录操作（参考依据：ThermoScientific反转录试剂盒）。1.8WesternBlot实验步骤（1）首先提取蛋白（2）使用SDS-PAGE试剂进行电泳（3）将其...
