广西医科大学学报JOURNALOFGUANGXIMEDICALUNIVERSITY2023Jan；40（1）基于CRISPR/Cas9技术构建GP73基因敲除小鼠模型及表型验证*徐艺心1，甄兰1，黄庆1，莫运海1，吴飞翔1,2,3△（1.广西医科大学附属肿瘤医院肝胆外科，南宁530021；2.广西肝癌诊疗工程技术研究中心，南宁530021；3.区域性高发肿瘤早期防治研究教育部重点实验室，南宁530021）摘要目的：基于CRISPR/Cas9技术构建高尔基体73（GP73）基因敲除小鼠模型并对其表型进行初步验证。方法：利用非同源末端连接（NHEJ）修复引入突变的方式，造成GP73基因蛋白读码框移码，使其功能缺失，针对GP73基因外显子4设计sgRNA靶位点，体外转录获得sgRNA，与编码Cas9的mRNA混合后通过受精卵显微注射方法获得F0代阳性敲除小鼠，通过繁育及基因型鉴定获得GP73基因敲除纯合子小鼠（GP73-/-小鼠）。采用实时荧光定量PCR（RT-qPCR）法检测肝、肾、皮下脂肪、棕色脂肪组织中GP73mRNA表达，采用酶联免疫吸附试验（ELISA）法检测血清GP73蛋白水平。结果：与野生型（WT）小鼠相比，GP73-/-小鼠肝、肾、皮下脂肪、棕色脂肪组织GP73mRNA及蛋白表达水平降低，血清GP73蛋白水平降低（均P＜0.05）。结论：基于CRISPR/Cas9技术成功构建了GP73基因敲除小鼠。关键词CRISPR/Cas9；GP73；基因敲除；基因型鉴定中图分类号：R392文献标志码：A文章编号：1005-930X（2023）01-0107-05DOI：10.16190/j.cnki.45-1211/r.2023.01.017ConstructionofGP73knockoutmousemodelbasedonCRISPR/Cas9technologyandpheno⁃typevalidationXuYixin1,ZhenLan1,HuangQing1,MoYunhai1,WuFeixiang1,2,3.(1.DepartmentofHepatobiliarySurgery,Affili-atedTumorHospitalofGuangxiMedicalUniversity,Nanning530021,China;2.GuangxiLiverCancerDiagno-sisandTreatmentEngineeringandTechnologyResearchCenter,Nanning530021,China;3.KeyLaboratoryofEarlyPreventionandTreatmentforRegionalHighFrequencyTumor,MinistryofEducation,Nanning530021,China)AbstractObjective：AGolgi73(GP73)knockoutmousemodelwasconstructedanditsphenotypewasinitial-lyvalidatedbasedonCRISPR/Cas9technology.Methods:Non-homologousendjoining(NHEJ)wasusedtore-pairandintroduceamutationthatcausedareadframeshiftintheGP73gene,resultinginalossoffunction.ThesgRNAtargetsitesweredesignedforexon4oftheGP73gene,andsgRNAwasobtainedbyinvitrotranscrip-tion.Afte...
