多重聚合酶链式反应技术检测罗非鱼5种常见食源性致病菌_杨亚琨.pdf

第 14 卷 第 2 期 食 品 安 全 质 量 检 测 学 报 Vol.14 No.2 2023 年 1 月 Journal of Food Safety and Quality Jan.,2023 基金项目:国家重点研发计划项目(2019YFC1605400)Fund:Supported by the National Key Research and Development Program of China(2019YFC1605400)*通信作者:董雨豪,博士,副研究员,主要研究方向为水产病原菌检测及致病机制研究。E-mail:*Corresponding author:DONG Yu-Hao,Ph.D,Associate Professor,Nanjing Agricultural University,No.1,Weigang,Xuanwu District,Nanjing 210095,China.E-mail: 多重聚合酶链式反应技术检测罗非鱼 5 种 常见食源性致病菌 杨亚琨,刘永杰,董雨豪*(南京农业大学动物医学院,南京 210095)摘摘 要要:目的目的 建立一种可同时检测无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、大肠杆菌(Escherichia coli)和沙门菌(Salmonella)5 种罗非鱼常见食源性致病菌的多重聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)方法。方法方法 根据 5 种致病菌特异性基因片段设计并合成引物,优化多重 PCR 体系条件,并对多重 PCR 体系的特异性、灵敏度以及人工模拟样品进行检测。结果结果 建立的多重 PCR 方法可同时扩增 5 种目的菌株的特异性条带,且不与非靶标细菌发生交叉反应。敏感性实验结果显示,该方法对无乳链球菌、嗜水气单胞菌、沙门菌、霍乱弧菌、大肠杆菌纯培养物基因组DNA 的检出限均为 0.4 ng/L。人工模拟样品检测结果显示,该方法可以快速且准确地检测上述 5 种食源性致病菌,且检出限可达到 2101 CFU/g。结论结论 本研究建立了一种可同时检测无乳链球菌、嗜水气单胞菌、霍乱弧菌、大肠杆菌和沙门菌 5 种罗非鱼常见食源性致病菌的多重 PCR 检测方法。该方法的建立为罗非鱼常见食源性致病菌的快速检测提供了重要的技术手段。关键词关键词:罗非鱼;食源性致病菌;多重聚合酶链式反应;快速检测 Determination of 5 kinds of common foodborne pathogens in Oreochromis niloticus by multiplex polymerase chain reaction technology YANG Ya-Kun,LIU Yong-Jie,DONG Yu-Hao*(College of Veterinary Medicine,Nanjing Agricultural University,Nanjing 210095,China)ABSTRACT:Objective To establish a method for simultaneous determination of 5 kinds of common foodborne pathogens in Oreochromis niloticus,including Streptococcus agalactiae,Aeromonas hydrophila,Vibrio cholerae,Escherichia coli and Salmonella by multiplex polymerase chain reaction(PCR).Methods Primers were designed and synthesized according to specific gene fragments of 5 kinds of pathogenic bacteria.The conditions of multiplex PCR system were optimized,and the specificity,sensitivity and artificial simulation samples of multiplex PCR system were detected.Results The established multiplex PCR method could simultaneously amplify the specific bands of 5 kinds of target strains without cross-reaction with non-target bacteria.The sensitivity test showed that the limit of detection of this multiplex PCR method was 0.4 ng/L for the genomic DNA of pure cultures of Streptococcus agalactiae,Aeromonas hydrophila,Salmonella,Vibrio cholerae,Escherichia coli.The artificially DOI:10.19812/ki.jfsq11-5956/ts.2023.02.019第 2 期 杨亚琨,等:多重聚合酶链式反应技术检测罗非鱼 5 种常见食源性致病菌 169 simulated sample testing showed that this method could quickly and accurately detect the above 5 kinds of foodborne pathogens,and the limit of detection could reach 2101 CFU/g for each pathogen.Conclusion A quintuple PCR method to identify 5 kinds of common foodborne pathogens in Oreochromis niloticus has been developed in this study.The establishment of this method provides an important technical means for the rapid detection of common foodborne pathogens in Oreochromis niloticus.KEY WORDS:Oreochromis niloticus;foodborne pathogens;multiplex polymerase chain reaction;rapid detection 0 引 言 罗非鱼是我国出口的最主要的水产品之一,作为世界上最大的罗非鱼出口国,我国每年的罗非鱼产量占全世界产量的 50%以上,罗非鱼产品安全在我国食品安全中占有不可忽视的地位12。食源性致病菌目前已成为危害罗非鱼食品安全,影响人类身体健康的一个关键问题,准确、快速检测罗非鱼中的食源性致病菌是控制食源性疾病暴发的必要手段。目前罗非鱼食源性致病菌的检测主要是针对无乳链球菌37,对其他致病菌的检测相对较少。然而,有研究表明罗非鱼在产品加工、包装、运输、储藏、销售等环节会因接触到环境中的多种病原菌而污染8。黎小正等9对广西省罗非鱼食源性致病菌污染情况的调查结果显示无论是采自养殖场的罗非鱼样品还是市售罗非鱼样品,均能检测出无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、沙门菌(Salmonella)和大肠杆菌(Escherichia coli)等多种食源性致病菌。李来好等10对采自广东省不同区域养殖场的罗非鱼样品检测结果显示,大肠杆菌、霍乱弧菌(Vibrio cholera)和嗜水气单胞菌检出率较高,其次为阪崎肠杆菌(Enterobacter sakazakii)、副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)等。因此,亟需建立一种快速、灵敏和特异性强的致病菌检测技术以预防和控制罗非鱼水产品食源性疾病的发生。目前,水生动物致病菌的检测通常采用常规培养分离和生化鉴定等技术。这种方法检测周期长、操作复杂、且检测单一,很难适应现代化食品安全快速检测的需要1112。尽管一些学者已经开发出可同时检测多种致病菌的多重聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)检测方法1315,例如,胡宗云等16建立了可同时检测 3种淡水鱼致病菌的多重PCR检测方法;蒋蔚等17建立针对水产品中霍乱弧菌、副溶血性弧菌和单增李斯特菌(Listeria monocytogenes)的三重 PCR 检测方法;王璐等18根据细胞兴奋性肠毒素基因和气溶素结构基因,建立了可快速检测嗜水气单细胞菌双重 PCR方法,但这些方法仅能检测 13 种致病菌,检测范围依然狭小,检测效率较低,且不适用于罗非鱼多种食源性致病菌的检测。为了实现对罗非鱼常见食源性致病菌的快速、灵敏、高通量检测,本研究以无乳链球菌 ef-t 基因、嗜水气单胞菌 ompA 基因、沙门菌 invA 基因、霍乱弧菌 ompW 基因、大肠杆菌 phoA基因作为目标基因,建立五重 PCR 检测体系,为罗非鱼中 5种常见食源性致病菌的快速高效检测提供重要的技术手段。1 材料与方法 1.1 实验菌株 嗜水气单胞菌 NJ-35、无乳链球菌 GD201008-001、沙门菌 SD-1 由本实验室保存;霍乱弧菌 VC0901、大肠杆菌 O157:H7、单核细胞增生李斯特菌 ATCC21635、创伤弧菌 ATCC27562(Vibrio vulnificus ATCC27562)、副溶血性弧菌 SH112、金黄色葡萄球菌 ATCC6538(Staphylococcus aureus ATCC6538)、阪崎肠杆菌 CICC21561 由上海兽医研究所蒋蔚研究员惠赠。1.2 试剂与仪器 琼脂糖(纯度 99%,凝胶强度1200 g/cm2,南京鼎国生物技术有限公司);2Taq PCR Mastermix(P111-01)、DNA Marker(MD101-01)(南京诺唯赞生物科技有限公司);细菌基因组提取试剂盒(D3350-01,美国 OMEGA Bio-Tek 公司);THB 培养基(HB0311,青岛海博生物技术有限公司);胰蛋白胨、酵母提取物(美国 Oxoid 公司);无水乙醇(分析纯,上海国药集团化学试剂有限公司)。DYY-2C 电泳仪(北京六一生物科技有限公司);NanoDrop 2000c Nano-Drop 核酸蛋白测定仪(美国 Thermo Fisher Scientific 公司);Mastercycler nexus PCR 扩增仪、5424 低温高速离心机(德国 Eppendorf 公司);Biorad Smartspec Plus 分光光度计、Gel Doc XR 凝胶成像仪(美国Bio-Rad 公司)。1.3 细菌基因组 DNA 提取 采用细菌基因组提取试剂盒提取细菌基因组 DNA。DNA 浓度采用 Nano Drop 仪器测定后,置于20冰箱中储存备用。1.4 引物设计与合成 从 GenBanK 数据库分别下载已发布的无乳链球菌、嗜水气单胞菌、霍乱弧菌、大肠杆菌和沙门菌的全基因组序列,经比较基因组学分析,筛选保守的靶基因,根据保守基因序列无乳链球菌 ef-t 基因(Gene ID:61438066)、嗜170 食 品 安 全 质