特产研究SpecialWildEconomicAnimalandPlantResearch1DOl:10.16720/j.cnki.tcyj.2022.164咖啡叶锈病菌单管巢式PCR检测体系的建立与应用吴伟怀1#，刘宝慧2#，汪全伟3，鹿鹏鹏1，贺春萍1,梁艳琼1,黄兴1，易克贤1,4※（1.中国热带农业科学院环境与植物保护研究所/农业农村部热带作物有害生物综合治理重点实验室，海南海口5711012.南京农业大学植物保护学院，江苏南京210095;3.中国热带农业科学院科技信息研究所，海南海口571101；4.中国热带农业科学院三亚研究院，海南三亚572000)摘要：由专性寄生菌咖啡驼孢锈菌（Hemileiavastatrix)引起的咖啡叶锈病是小粒种咖啡生产中的一种毁灭性病害，建立高效、准确的分子检测技术对于该病害的快速鉴定与监测具有重要意义。本研究基于咖啡叶锈病菌ITS序列保守区域设计该病原菌的单管巢式引物对，通过单因素试验筛选外引物与内引物退火温度后，进一步对单管巢式PCR检测反应体系的内、外引物浓度、dNTPs浓度、以及rTaq酶用量等4个关键因素进行正交优化试验，从而建立高效的单管巢式PCR检测反应体系。结果表明，咖啡叶锈病菌单管巢式PCR外引物HvF1/HvR1、内引物HvF2/HvR2的最佳退火温度分别为63℃与52℃。正交试验显示，在20μL的反应体系中各组分的最佳含量分别为:10×rTaqBuffer2.5μL,2.5mmol/LdNTPs3.2μL,rTaqDNAPolymerase(5U/μL)1.8μL,7μmol/L的HvF2/HvR2各1μL，1nmol/L的HvF1/HvR1各1μL，模板DNA1μL,ddH27.5μL。所建立的单管巢式PCR检测体系具有高度特异性，能从含有咖啡叶锈病菌DNA模板中检测出特异性条带，而其他供试的非咖啡叶锈病菌DNA模板中扩增不出任何条带。该检测技术体系的最低检测限为5fg/μL，是普通PCR灵敏度的100倍。采集的22份早期疑似病样经检测鉴定均含有咖啡驼孢锈菌。本试验建立的单管巢式检测技术可用于咖啡叶锈病菌的快速鉴定，可用于病害监测预警。关键词：咖啡叶锈病；驼孢锈菌；单管巢式PCR中图分类号：S435.712EstablishmentandApplicationofSingleTubeNestedPCRDetectionSystemforHemileiavastatrixCausingCoffeeLeafRust文献标识码：A文章编号：1001-4721(2023)05-0001-08WUWeihuail#,LIUBaohui2#,WANGQuanwei3,LUPengpengl,HEChunpingl,LIANGYanqiongl,HUANGXingl,YIKexianl.4*(1.KeyLaboratoryofIntegratedPestManagementonTropicalCrops,MinistryofAgricultureandRuralAffairs,KeyLabora-toryforMonitoringandControlofTropicalAgriculturalPests,EnvironmentandPlant...
