基金项目:国家重点研发计划项目(SQ2020YFA080008)作者单位:200433上海,复旦大学生命科学学院通信作者:张经纬,电子信箱:Jingwei_zhang@fudan.edu.cn建立大规模筛选病毒的核酸检测方法梁雪石云峰张经纬摘要目的开发快速、简便、可大规模对病毒进行筛选的核酸检测方法。方法通过集液滴生成、循环扩增、信号读取为一体的液滴数字聚合酶链反应(dropletdigitalpolymerasechainreaction,ddPCR)系统,以严重急性呼吸综合征冠状病毒2(se-vereacuterespiratorysyndromecoronavirus2,SARS-CoV-2)的ORF1ab和N基因为靶序列,以人甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyc-eraldehyde-3-phosphatedehydrogenase,GAPDH)为内参基因,进行核酸扩增并监测每个液滴的荧光信号。结果一体式DDPCR仪实现了“样本进-结果出”的简易操作。其水油体系与SARS-CoV-2检测试剂盒中试剂兼容,至扩增结束液滴稳定未融合,实现了实时检测区分出大量液滴中不同的荧光信号。恒温扩增条件下,最早可在第9min观察到带有三重荧光信号(FAM、HEX、CY5)的液滴。扩增过程中的实时荧光信号通过拟合后与实时荧光定量聚合酶链反应扩增曲线类似,包括基线期、指数期和平台期。各基因几百个液滴的扩增曲线显示,各液滴中无特异性扩增,同时Ct值分析结果显示,最早可在第12min得到扩增信号,达到鉴别目的。结论一体式ddPCR仪操作简便,液滴中反应迅速,可达到快速检测的目的。恒温扩增对反应设备要求较低,可大规模批量反应,同时拍照式信号采集可记录大量液滴的荧光信号,达到大规模筛选的目的。关键词一体式液滴数字聚合酶链反应严重急性呼吸综合征冠状病毒2恒温扩增中图分类号R331文献标识码ADOI10.11969/j.issn.1673-548X.2024.04.006EstablishmentofNucleicAcidDetectionMethodsforLarge-scaleScreeningofViruses.LIANGXue,SHIYunfeng,ZHANGJingwei.SchoolofLifeScience,FudanUniversity,Shanghai200433,ChinaAbstractObjectiveTodeveloprapidandsimplenucleicacidassaysforlarge-scalescreeningofepidemicviruses.MethodsThedropletdigitalpolymerasechainreaction(ddPCR)system,whichintegratesdropletgeneration,cyclicamplification,andsignalread-ing,wasusedtoamplifynucleicacidsandmonitorthefluorescencesignalofeachdroplettargetingtheORF1abandNgenesofseverea-cuterespiratorysyndromecoronavirus2(SARS-CoV-2)andhumanglyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase(GAPDH)geneasinternalreferencegene.ResultsTheint...
