酶联接免疫吸附测定酶联接免疫吸附测定,Enzyme-LinkedImmunosorbentAssay，简称ELISA，是以免疫学反应为基础，将抗原抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合起来的一种敏感性很高的实验技术。自上世纪70年代初问世以来，发展十分迅速，目前已被广泛应用于生物学、医学的许多领域。根据检测时标本以及检测目的等的不同，具体可以设计出不同类型的ELISA方法，如间接法、双抗夹心法、双位点一步法、竞争结合等。本教材以检测待测标本中肿瘤坏死因子TNFα的含量介绍双抗体夹心ELISA法。其基本原理是：抗人TNFα单克隆抗体被固相化在酶标板上，所加入标本中的抗原TNFα被酶标板上的单克隆抗体所捕获，通过洗涤以去除多余的或结合不牢固的抗原；被捕获的TNFα再与加入的生物素化的抗人TNFα二抗结合，通过洗涤以去除多余的或结合不牢固的二抗；生物素再与加入的亲和素-HRP结合，通过洗涤以去除多余的或结合不牢固的亲和素-HRP，HRP与最后加入的底物反应，形成有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。实验前准备实验开始前，需准备好实验所需的各种试剂和耗材：TNFα的ELISA检测试剂盒为：HumanTumorNecrosisFactorαELISAKit。此试剂盒中包含了实验所需的所有主要试剂。主要仪器和耗材有：ThermoScientific全波长扫描式多功能读数仪、芬兰百得的各个量程单通道移液器，赛默飞公司的QSP盒装吸头及冰盒等。接下来进入实验部分，本实验操作流程是：样品的稀释；样品与捕获抗体的孵育；洗涤；二抗孵育；洗涤；亲和素-HRP孵育；洗涤；底物显色；OD值的检测；标准曲线的绘制与标本中TNFα浓度的计算。样品稀释预先将冻干的人TNFα标准品溶解在适量超纯水中，溶解成浓度为2000pg/ml母液。取8只1.5ml离心管，做好浓度标记，分别是：1000、500、250、125、62.5、31.2、15.6、0pg/ml。分别吸取200μl的样品稀释液至8个离心管中，取200μl的标准品母液至第1个离心管中，漩涡混匀后吸取200μl至第2个离心管中，同样漩涡混匀后吸取200μl至第3个离心管中，依次稀释至第7个离心管，最后一个标记为零的离心管不含标准品，作为空白对照。免疫反应实验中所用到的试剂均需预先从冰箱中取出，室温恢复至常温。按每孔50μl往已包被了人TNFα单抗的酶标板中加入各组样品，每组样品2至3个复孔，首先加入1个空白对照样、然后是7个浓度的标准品、最后是两个稀释倍数的待测样品。加完后轻轻拍打酶标板数次混匀。注意：标...
