DNA甲基化检测甲基化是蛋白质和核酸的一种重要的修饰，调节基因的表达和关闭，在细胞正常发育、基因表达模式以及基因组稳定性中起着至关重要的作用，与癌症、衰老、老年痴呆等许多疾病密切相关，是表观遗传学的重要研究内容之一。目前甲基化特异性PCR,MethylmionSpecificPCR，简称MSP，及其改进方法是检测基因甲基化的经典方法．原理是首先用亚硫酸氢钠修饰处理基因组DNA，所有未发生甲基化的胞嘧啶都被转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶则不变。然后设计针对甲基化和非甲基化序列的引物并进行PCR扩增，通过检测，确定与引物互补的DNA序列的甲基化状态。MSP法灵敏度较高，应用范围广。实验前准备在实验开始前，先准备好本次实验所需的各种试剂，如：3mmolNaOH，DNA纯化试剂盒，以及PCR检测用到的试剂盒等。所涉及的仪器和耗材有赛默飞公司提供的单道移液器、QSP盒装吸头、Nun冰盒，ThermoScientific全波长扫描式多功能读数仪，还有常规的离心机、水浴锅等。本实验的操作流程为：引物设计，重亚硫酸盐修饰后进行DNA纯化，通过浓度检测方进行甲基化特异性PCR检测。首先进行引物设计甲基化常发生在启动子区，以DAPK1基因甲基化引物设计为例来。首先要找到DAPK1的启动子区，登陆MapViewer，搜索DAPK1。点击gene,filter，找到对应的基因，获得更多的信息。点击MapViewer，可见DAPK1在9号染色体的具体位置。第一个外显子位于90140kb处，估计启动子就在其上游2000kb内。显示为Genbank格式，点击display，获得序列。将得到的序列拿到PromoterScan中预测，获得该启动子的相关信息。预测结果的可靠性，需要通过实验证实。最后，登陆在线引物设计程序“MethPrimer”，将序列复制到框中，这选项是设计BSP引物，可根据需要设置参数。我们选择MSP引物，点击Submit获得MSP的5对引物。一般选择第一对引物进行实验。重亚硫酸盐修饰加1.0μl3mmolNaOH溶液到装有10μlDNA的PCR管中，DNA浓度一般为1ng-1μg，漩涡混匀。在37℃条件下孵育10min。加入120μl新鲜配制的DNAModificationReagent，漩涡混匀。70℃孵育40min。DNA纯化温育结束，立即加入500μlDNABindingBuffer,混合均匀。将ModifiedDNAPurificationColumn放置到2ml的CollectionTube中，加入修饰好的DNA样品到柱中，静置2min。11000×g离心1min，弃滤液。加700μlDNAWashBuffer到柱中，11000×g离心1min，弃废液。加200μl新选配制的DesulfonationSolution到柱中，室温静置15min。11000×g离心1min，去除流出液。...
