解螺旋陪伴医生科研成长http://www.helixlife.cn1RIP实验1.实验原理运用针对目标蛋白的抗体把相应的RNA-蛋白复合物沉淀下来，经过分离纯化对结合在复合物上的RNA进行分析.解螺旋http://www.helixlife.cn/2.实验目的已知蛋白，找与之相互作用的lncRNA3.实验材料3.1.主要试剂PBS(pH=7.4)10×多聚体裂解液5×NT-2bufferNET-2buffer。甲醛核重悬BufferIPBuffer蛋白酶K消化Buffer3.2.主要仪器离心机旋转仪涡旋振荡器4.实验步骤4.1.裂解液准备：1)细胞悬液1000rpm/min，4°C离心5min，弃上清；2)用1×预冷PBS洗2遍，弃上清；3)用等体积的1×多聚体裂解液重悬细胞，轻轻吹散，冰浴5min。4.2.磁珠与抗体准备：1)protein-A/G包被的磁珠充分重悬，取75μl至1.5mlEP管中；2)NT-2buffer洗涤2次；3)用100μlNT-2buffer重悬，加目标抗体5μg，室温混匀1h；解螺旋陪伴医生科研成长http://www.helixlife.cn24)5000g离心15s，加磁座吸附磁珠，弃上清；5)从磁座上取下管子，加1mlNT-2，吹打混匀，5000g离心15s，重复5次；6)900μlNET-2buffer重悬磁珠，冰浴备用。4.3.RIP：1)将存放在-80°C的细胞裂解液20000g，4°C离心10min；2)取100μl上清至制备好的900μlNET-2buffer重悬的磁珠中，进行抗体孵育，每个体系的体积为1ml；3)取出10μl的样品作为Input，-80°C保存备用；4)垂直混合器4°C过夜；5)离心将样品甩到管底，冰浴中将样品放到磁座上，放置1min后弃上清；6)加1mlNT-2，强力震荡混匀；7)离心将样品甩到管底，冰浴中将样品放到磁座上，放置1min后弃上清，重复5次；8)沉淀即为RIP实验获得的样品，可进一步通过蛋白酶K消化后提取RNA进行后续分析。解螺旋http://www.helixlife.cn/5.参考文献11.JiangR,TangJ,ChenY,etal.ThelongnoncodingRNAlnc-EGFRstimulatesT-regulatorycellsdifferentiationthuspromotinghepatocellularcarcinomaimmuneevasion.NatCommun2017;8:15129.
