高分辨熔解曲线分析技术高分辨熔解曲线分析技术，highresolutionmelting，简称HRM，是近几年来在国内外兴起的一种用于突变扫描和基因分型的最新遗传学分析方法。它是一种高效稳健的PCR技术，不受突变碱基位点与类型局限，无需序列特异性探针，在PCR结束后直接运行高分辨熔解，即可完成对样品突变、单核苷酸多态性-SNP、甲基化、基因分型等分析。HRM的主要原理是根据DNA序列的长度，GC含量以及碱基互补性差异，应用高分辨率的熔解曲线对样品进行分析，其极高的温度均一性和温度分辨率使分辨精度可以达到对单个碱基差异的区分。同许多荧光PCR技术一样，HRM是利用了特定的染料可以插入DNA双链中的特性，通过实时监测升温过程中双链DNA荧光染料与PCR扩增产物的结合情况记录高分辨率熔解曲线，从而对样品进行检测。实验前准备在实验开始前，先准备好本次实验所需的各种试剂，如：PCR检测用到的罗氏的LightCycler®480ControlKit和HighResolutionMeltingMaster等。HighResolutionMeltingMaster中含有2×MasterMix(包含热启动TaqDNAPolymerase反应缓冲液，dNTPmix，高分辨率染料),25mMMgCl2，PCR级别的H2O，用于调整反应的最终体系。本次实验所涉及到的仪器和耗材有：赛默飞公司提供的单道移液器、QSP盒装吸头、冰盒，罗氏的LightCycler®480，还有常规的离心机、水浴锅等。HRM体系配制实验中用到的HRM试剂盒需要对MgCl2溶液进行最近的浓度确认，以一管DNA样品为例展开实验。先加入1号管的2×MasterMix165μl，再加入9号管的primermix33μl，最后加8号管的mutation突变体33μl，混匀，瞬时离心，分装到相对应的管中。分装好做mutation样品的Mg2+浓度，以第1第2管来演示配制3.3倍体积加样。在1管中加入4μlMgCl2，再加入16μl水。同样地，在2管中加入5.3μlMgCl2和14.5μl水，其他管按照对应的体积配制即可。同时根据说明书配制好WT野生型和Het杂合子的样品。注意在配制过程中要吹打混匀。配制好反应体系后，各吸取20μl于96孔板中，设置3个重复。上样完毕，盖上盖板膜，确保其密封性。将96孔板放入LightCycler®480进行HRM的QPCR实验。程序设置打开软件，在NewExperiment界面下进行反应条件设定。样品体积为20μl，预变性95°C5min，无需采集荧光。在扩增反应中，设置45个Cycles，变性95°C10s，退火65°C10s，延伸72°C20s并收集荧光。设置溶解曲线，各参数如屏幕所示。设置完毕后，即可点击保存，并开始PCR反应。样品编辑点击SampleEditor进入样品编辑，...
