凝胶迁移实验(EMSA)凝胶迁移实验是一种研究DNA与蛋白质或RNA与蛋白质相互作用的常用技术，这项技术是基于DNA蛋白质或RNA蛋白质复合体在聚丙烯酰胺凝胶电泳中有不同迁移率的原理。本实验是将提取到的蛋白粗提液，与生物素标记的DNA一同保温，在非变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳上，分离复合物和非结合的探针。DNA复合物比非结合的探针移动得慢。EMSA中结合滞后条带的有无，以及量的多少可反映出DNA结合蛋白与DNA探针的结合活性，DNA结合蛋白的表达及活化水平。近年来，EMSA已发展成为体外研究核酸，尤其是DNA与蛋白质相互作用的一种简单，迅速，而灵敏的方法，已成为了转录因子与核酸体外相互作用的经典方法。实验前准备在实验开始前，先准备好本次实验所需的各种试剂盒和相关常规试剂，所需的试剂盒包括：核蛋白提取试剂盒，EMSA检测试剂盒等，需从冰箱里拿出室温解冻或冰上解冻待用。本次实验所需的耗材和仪器有：赛默飞公司提供的的ThermoScientific全波长扫描式多功能读数仪、QSP盒装吸头及Nunc冰盒，芬兰百得的各个量程单通道移液器，离心机，恒温水浴锅摇床等。下面进入实验部分，首先介绍本实验基本操作流程为，先进行核蛋白的提取以及定量，探针标记，随后进行凝胶的配置及预电泳，根据得到的核蛋白与探针，进行样品的制备，上样进行电泳，经过电泳分离后，转移到尼龙膜上，最后进行显色。核蛋白提取本步骤是参照NE-PERNuclearandcytoplasmicExtractionReagents展开的实验。首先将现用现配的BufferA和BufferC配置好，BufferA是1mlCERI加入10μl蛋白酶抑制剂，BufferC是1mlERBuffer加入10μl蛋白酶抑制剂.配置好，混匀后放置于冰盒中。取数量约为5×10^6-10^7/ml的待用细胞，用预冷PBS洗涤两遍，尽可能除去上清，勿留残液，估计离心后的压积细胞体积，每10μl体积，加入100μl的BufferA，混匀后涡旋剧烈振荡，冰上放置10-15min。加入11μl冷CERIIBuffer，混匀后剧烈振荡5s，放置冰上1min，再次振荡5s后，4℃，16000×g离心5min，尽快将上清转入另一预冷的洁净微量离心管，置于冰上，即得胞浆蛋白。在离心沉淀物中加入100μl预冷的BufferC，最大转速涡旋剧烈振荡15s，放置冰上40min，每间隔10min涡旋剧烈振荡15s；4℃，16000×g离心10min，尽快将上清转入一预冷的洁净微量离心管，即得核蛋白。上述提取的胞浆蛋白和核蛋白进行蛋白定量，分装并保存于-80℃，避免反复冻融。蛋白浓度测定选用的是BCA法进行测定，首先进行标准样品的准备，设定的标准样...
