解螺旋陪伴医生科研成长http://www.helixlife.cn1DNA甲基化芯片---以人肝细胞癌细胞DNA甲基化谱的检测及分析为例1.实验原理高通量甲基化芯片InfiniumHumanMethylation450KBeadChip能够对人全基因组45万个甲基化位点进行检测，覆盖了上一代27K甲基化芯片90%的位点，并同时增加了CpG岛以外的CpG位点、人类干细胞非CpG甲基化位点、正常组织与肿瘤（多种癌症）组织差异甲基化位点、编码区以外的CpG岛、miRNA启动子区域和已通过GWAS的疾病相关区域的位点。2.实验目的检测人肝细胞癌细胞的DNA甲基化谱，明确肝细胞癌细胞中差异甲基化位点和基因的表达分布情况，进一步探讨DNA异常甲基化与肝细胞癌发生发展的关系3.实验材料3.1.主要试剂人永生化肝细胞L02、人HCC细胞系Huh7均购自中国科学院细胞库；DNA提取试剂盒（QIAampDNAMicroKit）购自美国QIAGEN公司；甲基化修饰试剂盒购自沈阳百创特公司；人全基因组甲基化芯片（InfiniumHumanMethylation450KBeadChip）购自美国Illumina公司。解螺旋http://www.helixlife.cn/3.2.主要仪器核酸蛋白分析仪等。4.实验步骤4.1.DNA提取及甲基化修饰用0.25%含EDTA胰酶消化细胞，收集细胞沉淀，取20μLProteinaseK加入到1.5mL解螺旋陪伴医生科研成长http://www.helixlife.cn2Eppendorf管内，按DNA提取试剂盒说明书中的操作步骤提取Huh7、L02细胞DNA，NanoDrop核酸蛋白分析仪检测DNA提取纯度和浓度，若OD260nm/OD280mn在1.7-2.0之间则符合实验要求，则样品需要重新提取。将提取的Huh7、L02细胞DNA按照甲基化修饰试剂盒说明书中的操作步骤进行甲基化修饰。4.2.芯片杂交、扫描及数据分析按照Illumina公司提供的步骤进行芯片杂交数据扫描使用manifest文件，采用Illumina公司官方提供的MethylationModuleofGenomeStudiosoft-wareusingMethylationv1.9软件对芯片数据进行分析。β-value［β=intensityofthemethylatedallele（M）（/intensityoftheunmethylatedallele+intensityofthemethylatedallele+100］代表CpG位点的甲基化水平，数值越大，越趋近于1，甲基化程度越高。解螺旋http://www.helixlife.cn/β-difference（绝对值）为表达差异性分数。本研究使用empiricalayesoderated检验及Bonferroni校正来识别Huh7细胞和L02细胞之间的差异性甲基化CpG位点。初步筛选差异性甲基化CpG位点的纳入标准为经过校正的P值（AdjustP）≤0.05，同时表达差异性分数（|β-difference|）≥0.2，被定义为具有统计学意义。而AdjustP>0.05和CpG...
