1/7PCR产物的TA克隆(DNA的胶回收和连接)【实验原理】1.DNA片段回收方法：DNA片段在适当浓度的琼脂糖凝胶中，通上一定电压进行电泳，不同大小的DNA分子由于迁移率的不同而分离开。切下带有所需DNA片段的凝胶，用冻融法、玻璃奶回收法或商品化胶回收试剂盒将目的片段回收纯化。2.利用Taq酶能够在PCR产物的3’末端加上一个非模板依赖的A，而T载体是一种带有3’T突出端的载体，在连接酶作用下，可以把PCR产物插入到质粒载体的多克隆位点，可用于PCR产物的克隆和测序。商品化的T载体有很多。本实验采用TaKaRa公司的pMDTM18-TSimpleVector。这个载体以pUC19载体为基础，消除了pUC18载体上的多克隆酶切位点，经EcoRⅤ酶切后在两侧的3＇端添上“T”制备而成（见附录1）。由于本载体上消除了多克隆酶切位点，克隆后的PCR产物将无法使用载体上的限制酶切下，需要在PCR扩增引物上导入合适的酶切位点。【试剂与器材】（一）试剂1.pMDTM18-TSimpleVectorKit（Takara公司）。2.TAE电泳缓冲液3.琼脂糖（Agarose）4.6×电泳加样缓冲液：0.25％溴粉蓝，40％(w/v)蔗糖水溶液，贮存于4℃。2/75.溴化乙锭(EB)溶液母液：配制成10mg/mL，用铝箔或黑纸包裹容器，储于室温即可。6.70%乙醇7.胶回收试剂盒（Omega公司）（二）器材水平式电泳装置,电泳仪,台式高速离心机,恒温水浴锅,微量移液枪,微波炉或电炉,紫外透射仪,凝胶成像系统或其它照相设备。【操作方法】（一）胶回收试剂盒回收PCR产物（以Omega公司GelExtractionKit为例）1.当目的片段DNA完全分离时，转移凝胶至紫外灯上尽可能快地切下目的片段。2.凝胶块转移至1.5ml离心管(离心管已经称重了)中，称重得出凝胶块的重量。近似地确定其体积（假设其密度为1g/ml）。加入等体积的BindingBuffer（XP2），于55-65℃水浴中温浴7min或至凝胶完全融化，每2-3min振荡混合物。（在凝胶完全溶解之后，注意凝胶-Bindingbuffer混和物的pH值。如果其pH值大于8的话，DNA的产量将大大减少。如果是橙色或红色，则要加入5μl浓度为5M，pH为5.2的醋酸钠，以调低其pH值。该混合物的颜色将恢复为正常的浅黄色。）3.取一个干净的HiBindDNAMini柱子装在一个干凈的2ml收集管内（已备好）。4.将第三步获得的DNA/熔胶液全部转移至柱子中。室温下10,000xg离心1分钟。弃收集管中的滤液，将柱子套回2ml收集管内收集管。5.如果DNA/凝胶熔液的体积超过700ul，一次只能转移700ul至柱子中，余下的可继续重3/7复第5步至所有的溶液都经过柱子。每一个Hibin...
