Neon演示准备及操作步骤一、材料准备：以24孔板培养为标准：1．细胞：数量要求：0.5-5*105cells/well10μL体系，贴壁细胞，需要0.5-2*105cells/well。10μL体系，悬浮细胞，需要0.5-5*105cells/well。Note：保证细胞状态比较好，密度在70%-90%，在实验当天消化细胞，计数，计算活率。建议使用Countess细胞计数仪，30秒内获得准确的细胞量以及细胞存活率。2．质粒：浓度要求：1-5μg/μL，10μL体系加入的量不能超过1μL,根据下面具体的数据调整：10μL体系，贴壁细胞，加入的质粒量为0.5μg/well。10μL体系，悬浮细胞，加入的质粒量为1μg/well。Note：DNA纯度要高，以去离子水或TE溶解。建议使用Invitrogen的PureLinkHipureplasmidkit或者PureLinkHipureplasmidfilterkit抽提质粒。不建议使用国产试剂盒。加入质粒的体积不能超过转染总体积的10%。3．siRNA（做RNAi的客户）：浓度要求：500μM-1mM，根据下面具体的数据调整：10μL体系，贴壁细胞，siRNA的终浓度为100nM10μL体系，悬浮细胞，siRNA的终浓度为200nMNote：高质量的siRNA双链，溶于无核酸酶的水中。建议使用Invitrogen的stealthsiRNA。加入siRNA的体积不能超过转染总体积的10%。4．培养基：实验当天，24孔板中准备好含血清及添加剂，不含抗生素的培养基（与您需要转染细胞的一致的培养环境，仅扣除抗生素），500μL/孔，370C孵育备用。5.耗材及试剂：移液枪（至少20/100/1000μL各一支）一套；灭菌的枪头（10/200/1000μL各一盒）；灭菌的PBS缓冲液，不含钙镁离子；胰酶、血清及各种培养基添加剂等；75%酒精（棉球或喷壶都可以）；灭菌的离心管（1.5mL及15mL各一盒）；未开封的24孔细胞培养板；一次性无菌手套若干；已经过紫外处理超净工作台或安全柜；记号笔；白大褂；插线板（如电源离操作台面距离过远）；低速离心机；二氧化碳培养箱等常规设备。二、操作进行：1.仪器连接：必须保证连接紧密图1，移液枪基座与主机连接图2，电源线与主机连接2.Tube管安装：电极要对正（可听到咔嗒一声）3.用移液枪安装一个Tips，并吸取混匀的细胞和质粒（采用RBuffer重悬），放置到基座上：4.调整参数，按“Start”键：触摸屏上显示Complete(完成)，说明电穿孔已完成5.取下移液枪，将样本转移到培养基中：6．其他样本操作一样，最后电转结束，将培养板放置于37℃培养箱中培养。仪器放回包装箱。7.用户根据自己试验安排进行结果观察或检测。如果对试验环节或者结果有疑问，可咨询TechnicalSupport。如图3，将tube管放置在基座上面，并加3mL的EBuffer
