1/8mRNA的分离纯化【实验原理】真核生物的mRNA分子是单顺反子，是编码蛋白质的基因转录产物。真核生物的所有蛋白质归根到底都是mRNA的翻译产物，因此，高质量mRNA的分离纯化是克隆基因、提高cDNA文库构建效率的决定性因素。哺乳动物平均每个细胞含有约1x10-5gRNA，理论上认为每克细胞可分离出5～10mgRNA。其中rRNA为75％～85％，tRNA占10％～16％，而mRNA仅占1%～5％，并且mRNA分子种类繁多，分子量大小不均一，表达丰度也不一样。真核生物mRNA有特征性的结构，即具有5’端帽子结构（m7G）和3’端的poly(A)尾巴——绝大多数哺乳动物细胞的3’端存在20~300个腺苷酸组成的poly（A）尾，通常用poly（A+）表示，这种结构为真核mRNA分子的提取、纯化，提供了极为方便的选择性标志，寡聚（dT）纤维素或寡聚（U）琼脂糖亲合层析分离纯化mRNA的理论基础就在于此。一般mRNA分离纯化的原理就是根据mRNA3’末端含有多poly(A)尾巴结构特性设计的。当总RNA流经寡聚（dT）（即oligo(dT)）纤维素柱时，在高盐缓冲液作用下，mRNA被特异地吸附在oligo(dT)纤维素柱上，在低盐浓度或蒸馏水中，mRNA可被洗下，经过两次oligo(dT)纤维素柱，即可得到较纯的mRNA。目前常用的mRNA的纯化方法有：（1）寡聚（dT）－纤维素柱层析法，即分离mRNA的标准方法；（2）寡聚（dT）－纤维素液相离心法，即用寡聚（dT）－纤维素直接加入到总的RNA溶液中并使mRNA与寡聚（dT）－纤维素结合，离心收集寡聚（dT）－纤维素／mRNA复合物，再用洗脱液分离mRNA，然后离心除去寡聚（dT）－纤维素；2/8（3）其它一些方法：如寡聚（dT）－磁性球珠法等。本实验应用方法（1）进行mRNA的分离纯化。【试剂与器材】（一）试剂1．0.1mol/LNaOH，每组200mL2．寡聚Oligo（dT）-纤维素3．加样/洗涤缓冲液1：0.5mol/LNaCl,20mmol/LTris-HCl(pH7.6)，每组250mL或0.5mol/LNaCl,20mmol/LTris-HCl(pH7.6),1mmol/LEDTA(pH8.0),0.1%SDS。4．洗涤缓冲液2：0.1mol/LNaCl,20mmol/LTris-HCl(pH7.6)，每组250mL或10mmol/LTris-HCl(pH7.6),1mmol/LEDTA(pH8.0),0.05%SDS。配制时可先配制Tris-HCl(pH7.6)、NaCl、EDTA（pH8.0）的母液，经高压消毒后按各成分确切含量，经混合后再高压消毒，冷却至65℃时，加入经65℃温育（30min）的10%SDS至终浓度。5．5mol/LNaCl，每组10mL6．3mol/LNaAcpH5.2，每组10mL7．无RNase双蒸水(DEPC水)，每组100mL8．70%乙醇，每组10mL注意：溶液5，6的配制都应该加0.1%DEPC处理过夜，溶液1，3，4...
