解螺旋陪伴医生科研成长http://www.helixlife.cn1Co-IP（免疫共沉淀）1.实验原理免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质－蛋白质间的相互作用被保留了下来。当用预先固化在argarosebeads上的蛋白质A的抗体免疫沉淀A蛋白，那么与A蛋白在体内结合的蛋白质B也能一起沉淀下来。再通过蛋白变性分离，对B蛋白进行检测，进而证明两者间的相互作用。这种方法得到的目的蛋白是在细胞内与兴趣蛋白天然结合的，符合体内实际情况，得到的结果可信度高。这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合；也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。解螺旋http://www.helixlife.cn/2.实验目的探究两个蛋白是否有相互作用的实验方法之一。3.实验材料3.1.主要试剂（试剂来源仅供参考）试剂来源ProteinAbeadsGEProteinGbeadsGEAntibodiesCST等LysisbufferECL发光液解螺旋陪伴医生科研成长http://www.helixlife.cn23.2.主要仪器（仅供参考）仪器名称来源离心机Thermo电泳仪Bio-rad垂直混合仪超声破碎仪4.实验步骤1.选择合适的细胞系（内源实验）或者293T细胞中过表达想要研究的蛋白（外源实验）。注意：所有过程均在冰上操作。（基因表达请见分子克隆、质粒转染）2.取600ul-1ml的lysisbufferpre-cold裂解细胞（视细胞量而定，外源实验35mmDish即可。内源实验一般需要60mm及以上的Dish，细胞汇合度达80%以上）3.用细胞刮将细胞刮至1.5mlEP管中。超声破碎细胞。功率30%，10-20s.4.离心沉淀细胞碎片（13000rpm15min）5.准备新的EP管，IP用。每管中加入5ul洗好并混好的A+Gbeads（用lysisbuffer清洗，3000rpm1min清洗三次，置换beads的储存buffer至lysisbuffer）。6.每管中中加入所要IP的蛋白的抗体，约5ul,每组实验以相应的IgG抗体作为对照。7.另准备一批EP管，加入制样的buffer（2XSDSbuffer），直接制样，作为input用。8.取小部分离心后的上清直接制样，剩余上清加入IP管中。9.垂直混合仪4度rotate过夜（外源实验3-4小时即可）。10.用lysisbuffer清洗rotate过后的beads，之后弃上清制样。用1XSDSbuffer制样。11.Westernblottign检测结果。解螺旋http://www.helixlife.cn/5.应用示例文献1,21.BleeAM,LiuS,WangL,HuangH.BETbromodomain-mediatedinteractionbetweenERGandBRD4...
